HPLC法同時測定參附注射液中五種人參皂苷的含量

曹麗梅，趙萱*，劉婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

·炮制制劑·

HPLC法同時測定參附注射液中五種人參皂苷的含量

曹麗梅，趙萱*，劉婷婷，唐敏，李茜，潘媛，傅超美

目的：建立同時測定參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5種主要皂苷成分含量測定高效液相色譜法。方法：采用Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈（B）-水(A)二元梯度洗脫；在203 nm波長下進行含量測定。結果：表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd分別在31.72～158.60、11.43～57.15、129.87～649.35、117.30～586.50、18.71～93.55 μg·mL-1線性范圍內線性關系良好（相關系數均大于0.995），平均加樣回收率分別為98.28%、98.14%、99.40%、96.80%、98.63%。結論：同時測定參附注射液中上述5種成分，方法簡便、準確、分離度好、重現性好，可用于參附注射液的質量控制；采用此種多成分、多指標評價中藥注射劑的方法，更能體現產品的活性成分群及功能主治，控制產品有效性。

參附注射液；HPLC法；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rc；人參皂苷Rd

自上個世紀30年代柴胡注射液首次問世以來，注射劑已經過八十多年的臨床應用，取得了一系列令人矚目的成績，形成了“理論可靠、制劑有道、臨床顯效”的科學體系，尤其是中藥注射液在治療危、急重癥及慢性疾病方面的特殊優(yōu)勢，使得中藥注射液在現代中醫(yī)藥領域具有無可替代的地位。參附注射液源自七百年之古驗方參附湯，是在中醫(yī)藥理論指導下，結合“整體活性、去雜存精”制劑原則和“直入血分、速效救急”臨床應用的成功劑型改革典范。參附注射液臨床應用劑量安全范圍寬、毒副作用小，被廣泛用于肺源性心力衰竭[1]、冠心病慢性心力衰竭[2]、充血性心力衰竭[3]、急性心力衰竭[4]的治療，并取得了顯著療效。此外也抗休克[5]，對缺血再灌注損傷具有保護作用[6]。

中藥注射劑具有多成分、多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用和整體效應。有學者采用“譜-效結合”方法研究參附注射液的化學成分，分離出于抗溶血作用有關的20種人參皂苷和6種烏頭類生物堿，而目前多只以人參皂苷Rb1作為衡量制劑質量的指標[7]，難以體現中藥復方注射液組方中“藥有個性之特長，方有合群之妙用”的物質基礎之“活性成分群”。另有文獻報道謝華等采用高效液相法測定參附注射液中人參皂苷僅Rg1和Re兩個成分的含量[8]。本試驗選擇參附注射液中5種主要皂苷類成分作為參附注射液中紅參含量測定的指標成分，建立了快速同時測定5種皂苷成分的HPLC含量測定方法，對建立參附注射液更完善的質量控制體系有一定的科學的參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀（包括四元梯度泵單元、自動脫氣單元、自動控溫進樣單元、DAD多波長檢測器單元和Chem Station 色譜工作站等)。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm），美國Agilent Techologies 公司；CP225D型和BS210S型電子天平，德國Sartorius公司；KH—300DB型數控超聲儀，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司

1.2 試藥

對照品人參皂苷Rg1（批號：MUST-16022407）、人參皂苷Re（MUST-16012701）、人參皂苷Rb1（MUST-16021907）購于成都曼斯特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所；對照品人參皂苷Rc（PS160414-05）、人參皂苷Rd（PS10051301）購于成都市普思生物科技有限公司，所有對照品經HPLC峰面積歸一化法檢測質量分數均在98%以上。乙腈為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。參附注射液（批號：15110701004、150914010、150912010，10 ml/支）購于雅安三九藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法測定參附注射液中5種有效成分含量

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A為水，流動相B為乙腈，二元梯度洗脫程序為：0-25 min,20%-20%B；25-30 min,20%-30%B；30-45 min,30%-40%B；45-50 min,40%-19%B。體積流量1 mL·min-1；檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，進樣量10μL。對照品1、SF Injection 2色譜圖。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對照品適量，以甲醇溶解并定容，搖勻，制成適宜質量濃度的混合對照品溶液，置冰箱備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取參附注射液適量，過0.22 μm的微孔濾膜，既得。

圖A 對照品圖譜 (t/min)

圖B 參附注射液樣品圖譜 (t/min)1.人參皂苷Rg12. 人參皂苷 Re 3. 人參皂苷Rb1

2.1.4 系統適應性及專屬性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液及SFI10 μL，按“2.1.1”項下方法進行檢測，結果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子均在在0.97～1.03范圍內，理論塔板數以各色譜峰計算均在6000以上，方法專屬性良好。

2.1.5 線性關系考察 分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對照品適量，以甲醇溶解并定容，搖勻，配制成一系列不同質量濃度的5種混合對照品溶液。Rg1的質量濃度為31.72、63.44、95.16、126.88、158.60 μg·mL-1；Re的質量濃度為11.43、22.86、34.29、45.72、57.15 μg·mL-1；Rb1的質量濃度為129.87、259.74、389.61、519.48、649.35 μg·mL-1；Rc的質量濃度為117.30、234.60、351.90、469.20、586.50 μg·mL-1；Rd的質量濃度為18.71、37.42、56.13、74.84、93.55 μg·mL-1。按“2.1.1”項下色譜條件測定，進樣量10 μL，記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到回歸方程、相關系數（γ）和線性范圍，結果見表1。

表1 5種成分的回歸方程和線性關系考察

2.1.6 精密度試驗 取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μl，按“2.1.1”項下方法進行檢測，記錄各組色譜峰峰面積。結果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd峰面積的RSD分別為1.21%、1.26%、1.31%、1.19%、1.33%。

2.1.7 重復性試驗 取同批次參附注射液，按2.1.3項下供試拼溶液的制備方法，制成6份供試品溶液，按“2.1.1”項下方法測定，計算各物質的質量濃度，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的平均質量濃度分別為51.73、22.33、156.85、140.36、34.38 μg.mL-1，RSD分別為1.18%、1.47%、1.86%、1.59%、1.30%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 參附注射液，室溫放置，分別于制備后0、1、2、3、6、12、24 h注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項下方法測定，記錄人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的峰面積，RSD分別為0.42%、0.73%、0.23%、0.82%、0.51%；試驗結果表明供試品溶液在24小時內穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取適量的對照品,甲醇溶解,定容,搖勻,制備成質量濃度與已測定參附注射液（批號：5110701001）相近的混合對照品溶液.分別精密量取0.12、0.20、0.28 mL的參附注射液與混合對照品溶液，制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率。

表2 參附注射液的加樣回收率試驗結果(n=3)

2.2 參附注射液樣品測定

取3批樣品，分別制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進樣，測定3次，記錄各色譜峰的峰面積。計算3批參附注射液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd五種皂苷的質量分數。結果見表3。

表 3 參附注射液中5種人參皂苷成分測定結果（n=3）

3 討論

影響中藥注射劑安全與有效性的因素很多，最主要的環(huán)節(jié)是注射劑的制備工藝，而中藥注射劑的活性成分具有多成分，多靶點，多作用的特點，通過復方中多種有效成分的相互協調作用，發(fā)揮其更好的臨床療效。所以應盡可能選擇多成分、多指標評價產品的質量，以保證參附注射劑的臨床療效。本試驗首次建立HPLC同時測定參附注射液中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5種主要人參皂苷含量的測定方法。試驗過程中，還比較了202 nm波長和203 nm波長對皂苷含量的影響，結果表明5種皂苷均在203 nm處有最大吸收，受雜質的影響甚微，且基線平穩(wěn)，準確度高。通過比較Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）和Agilent Elispe XDS- C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用水-乙腈二元梯度洗脫，試驗結果表明Agilent ZORBAX SB-C18柱（ 4.6 mm×150 mm，5 μm）分離效果更好，分離時間短。

[1] 季文.參附注射液治療肺源性心臟病心力衰竭的臨床觀察[J].山西醫(yī)藥雜志, 2004,33(1):79-80.

[2] 張志民.參附注射液治療老年性冠心病慢性充血性心力衰竭30例[J].福建中醫(yī)藥,2003,34( 4):24-24.

[3] 賀抒，謝曉芳，張雪，等.附子水溶性物堿對心衰細胞模型的治療作用[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(16):127-131.

[4] 李洪峰.參附注射液對急性心力衰竭患者血漿腦鈉肽水平的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2011,18(4):347-348.

[5] 徐菲飛,彭成,王茁伉,謝曉芳.參附注射液對新生大鼠心肌細胞ATP酶及相關離子的影響[J].中藥藥理與臨床2013,29(3):19-21.

[6] 麻日虎,李瑩, 王玉璇.參附注射液后處理對肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥物與臨床, 2013, 13:437-439.

[7] 楊瑞杰.參附注射液化學成分研究[D].吉林大學化學學院碩士學位論文,2012.

[8] 謝華,王硯,劉仲義等.參附注射液中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量測定[J].華西藥學雜志,2006,21(2):208-209.

(責任編輯：傅舒)

Simultaneous determination of fve components in School of pharnacy, Shenfu injection with HPLC method

/CAO Li-mei, ZHAO Xuan,LIU Ting-ting, TANG Min, LI Qian, PAN Yuan, FU Chao-mei //(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the method for simultaneous determination of ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd in Shenfu injection by HPLC. Method: Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150mm，5μm) column was used in detection with a gradient mobile phase system consisting of water and acetonitrile. The wavelength of DAD detector was set at 203nm for analytes detection. Result: The results shows that ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rd have a good correlation among linear ranges of 31.72～158.60, 11.43～57.15, 129.87～649.35, 117.30～586.50, 18.71～93.55 μg·mL-1, respectively(γ＞0.9995). The average recovery was 98.28%, 98.14%, 99.40%, 96.80%, 98.63% respectively. Conclusion: This method can be used as a quantitative analysis for Shenfu Injection content determination.

Shenfu injection ; HPLC; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rc; ginsenoside Rd

R285.5

A

1674-926X(2016)06-006-03

國家自然科學基金委青年基金項目編號（81503266）

成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137;

曹麗梅（1991-），碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術與新工藝研究 Email:410501297@qq.com

趙萱（1986-），碩士，講師，從事中藥新制劑、新技術與新工藝研究 Email:626098860@qq.com

2016-05-10