虎杖藥渣纖維素降解菌的篩選及酶活性測定

吳清華，王輝，馬云桐， 譚友莉， 王承明，劉薇

·炮制制劑·

虎杖藥渣纖維素降解菌的篩選及酶活性測定

吳清華1，王輝2，馬云桐1， 譚友莉1， 王承明1，劉薇1

目的：以虎杖藥渣和羧甲基纖維素鈉為碳源，通過平板初篩及多種酶活性綜合測定，篩選出具有降解纖維素作用的菌種。方法：通過不同培養(yǎng)基及菌種水解圈的大小作為指標，篩選纖維素降解菌并通過菌種發(fā)酵測定虎杖藥渣纖維素酶的活性。結(jié)果：初篩得到7種具有降解虎杖藥渣的纖維素降解菌，各種菌種的活性差異較大。結(jié)論：通過本實驗研究虎杖藥渣中纖維素降解菌與酶活性的關系，探索生物酶處理技術(shù)應用于虎杖藥渣中的前景，為藥渣的再次開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

藥渣；纖維素降解菌；纖維素酶

中藥藥渣來源于中成藥原料藥生產(chǎn)、中藥飲片的加工與炮制，以及含中藥成分的輕化工產(chǎn)品的生產(chǎn)等，其中以中成藥生產(chǎn)帶來的藥渣量最大，約占藥渣總量的70%[1]。目前，隨著中草藥和中成藥的應用日益廣泛，提取藥用成分后產(chǎn)生的藥渣也逐年增加，由于目前藥渣的處理技術(shù)還不完善，導致許多藥廠集中地區(qū)藥渣堆積如山。據(jù)統(tǒng)計，我國僅植物類藥渣年排放量就高達65萬多噸[2]。如果將這些藥渣簡單的堆放在外面，不僅會造成環(huán)境污染，還會給周邊居民的生產(chǎn)和生活造成嚴重危害，同時也增加了企業(yè)處理這些藥渣的經(jīng)濟負擔，如何有效處理這些藥渣的問題已日益突出。本研究的目的就是利用以纖維素為唯一碳源的方法從土壤中篩選出高效無毒的纖維素降解菌，再從中復篩出較好的菌株，以便將藥渣進行再次開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 虎杖藥渣 四川巴中普瑞制藥廠生產(chǎn)的解毒降脂片（虎杖單味藥制劑）提取過后的藥渣，曬干，打粉。

1.1.2 含菌樣品 淺層土壤樣品：在采集地選取1 m2范圍內(nèi)多個不同點采集腐殖質(zhì)較厚、地表層濕潤且肥沃的土壤樣品2 cm3，裝入采樣袋密封。

深層封土樣品：在腐殖質(zhì)含量較高且濕潤的地方，取地下5 cm深處的土樣1 cm3，裝入同一密封袋混合均勻后密封。

含菌木樣：選取腐化程度較高的植物枝葉樣品，或者有真菌生長的死亡枝干，用工具取下5 cm左右長度樣品于密封袋中密封。采樣完成后編號并立即帶回實驗室，保存于4 ℃的冰箱中備用。

1.1.3 培養(yǎng)基[3]富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.4 g，K2HPO42.0 g， MgSO4?7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4?7H2O 5.0 mg，CaCl20.3 g，MgSO4?H2O 1.6 mg， CoCl22.0 mg， ZnSO41.7 mg，虎杖藥渣粉30 g 用蒸餾水定容至1 L。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：MgSO4?7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，KH2PO40.5 g，CMC-Na 15.0 g，瓊脂20 g；用去離子水定容1 L，pH自然，121 ℃滅菌。

纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.0 g，MgSO40.5 g，CMC-Na 20 g，瓊脂20 g，剛果紅 0.2 g，用去離子水定容1 L，PH自然，121 ℃滅菌。

保藏培養(yǎng)基--PDA培養(yǎng)基(W/V )：去皮馬鈴薯200 g；葡萄糖 20 g；蛋白胨10 g； MgSO4?7H2O 1.5 g； KH2PO43 g；瓊脂粉 20 g；維生素B1 10 mg；蒸餾水 1000 ml，溫度105 ℃，滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 稱取菌種來源樣品各5 g，加入以虎杖藥渣為惟一碳源的100 mL富集培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)7-10天，吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的富集培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)3次。

1.2.2 菌種初篩 取傳代3次的培養(yǎng)液適當稀釋，在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上分離純化菌種，觀察培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)水解環(huán)以及水解環(huán)的大小。同時參考水解環(huán)產(chǎn)生的先后及清晰度，初步比較不同菌株的纖維素酶活性，并確定用于酶活性測定的菌株。

1.2.3 酶活性測定[4,5]采用DNS還原糖法測定各纖維素酶活性。總酶活（FPA）的測定：取2支15 mL刻度的試管，各加1.0 mL粗酶液，再加pH7.0的Tris-HCl緩沖液1.0 mL。測定管加入1 cm×6 cm濾紙條，充分浸泡于50 ℃恒溫水浴60 min，空白管同時置于50 ℃恒溫水浴60 min。然后分別加入DNS顯色液1.5 mL，空白管同時加入1 cm×6 cm濾紙條。沸水浴5 min，冷卻后加水定容至15 mL，以空白管凋零點，在540 nm處測OD值。內(nèi)切酶酶活（Cx）的測定：取2支15 mL刻度的試管，各加1.0 mL粗酶液。測定管加1.0 mL1%的CMC-Na，空白管只加pH7.0的Tris-HCl緩沖液1.0 mL。然后置于50 ℃恒溫水浴60 min。再分別加入DNS顯色液1.5 mL，置沸水浴鍋反應5 min，冷卻后加水定容至15 mL，以空白管凋零點，在540 nm處測OD值。β一葡萄糖苷酶（ Cb）酶活測定需把Cx測定中的CMC-Na（質(zhì)量分數(shù)1%）換成水楊苷（質(zhì)量分數(shù)0.5%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種初篩結(jié)果

將來自堆放的腐爛植物的肥沃土壤及深層封土等作樣品，在以虎杖藥渣為惟一碳源的培養(yǎng)基中進行3次傳代培養(yǎng)，取其菌液涂布于CMC-Na固體培養(yǎng)基中，待其長出菌落后，進行平板劃線法分離，分離得到一系列纖維素降解菌。然后將分離得到的纖維素降解菌分別接種在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上觀察其生長情況。纖維素降解菌能快速地在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的水解環(huán)。試驗表明，其中有7種菌種在平板上能較快地產(chǎn)生較大的水解環(huán)。圖1是選取其中2種菌株在培養(yǎng)基上的水解環(huán)，說明它們具有較高的纖維素酶酶活。

圖1 其中2種菌株在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基中的水解環(huán)

2.2 菌種復篩結(jié)果

纖維素的降解是多種酶相互作用的結(jié)果，多酶體系包括內(nèi)切酶、外切酶、β一葡萄糖苷酶3種主要成分。為此選擇FPA、Cx、Cb3種酶活大小作為菌種的復篩依據(jù)。

將菌種分別接入以藥渣和CMC-Na為碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)5～7 d后的酶活性測定結(jié)果如表1所示。通過對以藥渣和CMC-Na為碳源的兩種發(fā)酵方式進行酶活性測定，篩選得到了7株酶系組成不同的菌株。由試驗結(jié)果可知，對于FPA和Cx，以藥渣為碳源的2、7號菌株和以CMC-Na為碳源的5、7號菌株較高，且它們的Cx與其他菌相比差異較大；Cb相對于其他其他酶活差異較大，Cb和FPA 在菌株之間差異都較小。酶活測定結(jié)果與水解環(huán)測定結(jié)果基本吻合，進一步驗證了用纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基平板篩選纖維素降解菌的方法是比較合理可行的。

表1 菌種發(fā)酵酶活測定結(jié)果

3 討論

為了獲得盡可能多的優(yōu)良降解菌，一般采用多種方法對纖維素降解菌進行篩選。本試驗采用傳統(tǒng)纖維素-剛果紅培養(yǎng)基平板法進行初篩和多種纖維素酶活綜合測定進行復篩相結(jié)合，以防止遺漏優(yōu)良菌種。通過篩選得到了7株酶活較高的菌種，其中6、7號菌株的酶活最好，對其以藥渣為碳源的發(fā)酵，F(xiàn)PA分別達7.750、7.417 U/mL，Cx分別為11.750、18.083 U/mL，Cb分別為99.750、21.500 U/mL。說明了纖維素的降解是多種酶體系協(xié)同作用的結(jié)果，以多種酶指標進行纖維素降解菌的篩選是一種更為有效的篩選方法。

今后可以結(jié)合藥渣降解，進一步加強微生物參與利用纖維素降解生產(chǎn)，這對緩解能源危機和環(huán)境污染等問題具有重要影響。纖維素酶是目前糖苷酶類中唯一尚有大量亟待解決問題的酶，同時也是有著巨大工業(yè)和市場潛力的酶[6]。進一步闡明纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能，纖維素的高效降解與微生物之間的相互作用關系還需要作更深入的研究。

[1] 劉萍,張海英.試論中藥藥渣的合理利用[J].新疆中醫(yī)藥, 2006,20(6):49.

[2] 楊磊,夏祿華,張衷華,等.植物提取生產(chǎn)中固形廢棄物生態(tài)化利用的現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代化工,2008,28(4):14.

[3] 劉韜滔,淑霞龍,傳南,等.纖維素降解菌L-06的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件的分析[J].生物工程學報,2008,24(6):1112-1116.

[4] 張楠,楊興明,徐陽,等.高溫纖維素降解菌的篩選和酶活性測定及鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2010,33(3):82-87.

[5] 劉長莉,王小芬,牛俊玲,等.一組纖維素分解菌復合系NSC-7的酶活表達特征[J].微生物學通報,2008,35(5):720-724.

[6] 顧方媛,陳朝銀,石家驥,等.纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢[J].微生物學雜志,2008,28(1):83-87.

(責任編輯：傅舒)

Screen and enzyme activity determination of cellulose degrading bacteria from Huzhang

/WU Qing-hua1, WANG hui2,MA Yun-tong1, TAN You-li1, WANG Cheng-ming1, LIU Wei1//(1. National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2.Key Laboratory of Distinct Plant Development Research, Dazhou College of Arts and Sciences, Dazhou 635000, Sichuan)

Objective: Using cellulose residue and carboxymethyl cellulose sodium as carbon source, the strains with cellulose degrading effect were screened out by plate screening and enzyme activities determination . Method: Cellulase degrading bacteria were screened by different culture medium and the size of hydrolysis loop of the strain. Cellulase activity of Huzhang residue was determined by fermentation. Result: Seven kinds of cellulolytic bacteria which can degrade drug residue were obtained with various enzyme activities. Conclusion: In this study, the relationship between cellulolytic bacteria and enzymatic activity in the residue of Huzhang is studied. The prospect of biological enzymatic treatment in the residue of Huzhang is explored to provide the theoretical basis for further development and utilization of drug residue.

Dregs; cellulose degradation bacteria; cellulase

R 283.5

A

1674-926X(2016)06-007-02

四川省高校重點實驗室四川文理學院特色植物開發(fā)研究重點實驗室開放課題（sctz201303）

1. 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；

2.四川達州文理學院特色植物開發(fā)研究重點實驗室，四川 達州 635000

吳清華（1986-），博士，女，講師，從事中藥品種、品質(zhì)與質(zhì)量評價

2016-04-10