固定化技術在偶氮染料廢水處理中的應用技術

張　昊，崔岱宗，張　淼，趙　敏（東北林業大學微生物實驗室，黑龍江哈爾濱　150040）

?

固定化技術在偶氮染料廢水處理中的應用技術

張昊，崔岱宗，張淼，*趙敏
（東北林業大學微生物實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：研究利用固定化包埋的方法，將1株偶氮染料降解菌固定于聚乙烯醇（PVA）顆粒內部，并測定其在好氧條件下對染料的降解特性。研究表明，聚乙烯醇（PVA）在包埋過程中相對其他2種載體（明膠和海藻酸鈉）有球型好、硬度大、不易黏連、耐受高溫等優點。染料降解試驗表明，該固定化顆粒在反應體系溫度為40℃，pH值為5～6的環境中有最佳降解速率。包埋后的細菌相對于游離細菌可以連續使用更多的次數，在保持球型完整的情況下可連續使用8次以上，在實際應用中具有重要的意義。

關鍵詞：固定化；聚乙烯醇；偶氮染料；微生物降解

目前，染料廢水的排放量占工業廢水排放總量的10%，并且隨著現代染料與印染工業規模的擴大，染料廢水的排放量還在不斷升高。在全球范圍內，每年都有15%的染料廢物被排放到環境中，對全球范圍內的生態環境造成了極大的威脅[1]。染料廢水的顏色濃度高、化學組成復雜，且其所含的有機物大多是具有致癌、致畸、致突變能力的物質[2-3]。若不經過處理直接排放，會給生態環境帶來嚴重威脅，對人類健康和農業生產發展產生嚴重影響。偶氮染料生產成本低、生產工藝成熟、色光良好且不易褪色，因而廣泛應用于紡織品及皮革制品的染色工藝中[4]。其化學性質比較穩定，成分比較復雜，是公認處理難度較高的有機廢水[5]。

利用微生物在繁殖過程中的生長代謝來分解廢水中有機物的方法叫做生物法。微生物有體積小、表面積大、繁殖速度快的優勢，且微生物細胞內的降解酶具有專一性和高效性，對環境的抗逆性強[6]。因此，生物法是目前最為環保的染料降解方法，有著廣闊的應用前景。

固定化技術主要包括載體結合法、交聯法和包埋法，其中包埋法是固定化技術中較為理想的方法[7]。利用高分子聚合物在聚合的過程中會形成類似于孔隙的間隔，將相對較小的微生物細胞包埋在孔隙中，從而達到細胞固定的目的。該方法操作簡單，可以將微生物固定在聚合物所形成的特殊空間當中，且這種結構較為緊密，可以防止細胞在空間中流動滲漏[8]。然而，分子質量相對較小的染料底物和細胞產物則可以在孔隙中自由流動，對細胞毒害作用較小，固定化強度較高、穩定性較好。

本試驗利用1株偶氮染料降解菌H10，通過細胞培養和微生物固定化技術將其包埋，再通過染料降解試驗探索和優化細菌固定化的條件，以及固定化顆粒對偶氮染料的降解效果和其在降解體系中的連續使用能力，為實際應用打下基礎。

1　試驗材料與方法

1.1驗材料

本試驗所使用的菌株H10分離于遼寧海城某印染廠附近長期受偶氮染料污染的土壤中。經研究表明，H10菌株可在有氧條件下，對偶氮類染料進行高效降解。海藻酸鈉、甲基紅、聚乙烯醇（PVA）、明膠、碳酸氫鈉、胰蛋白胨、硼酸、戊二醛、氯化鈣、液體石蠟、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、酵母提取物等均為國產分析純，購于天津光復精細化工有限公司。

1.2驗方法

1.2.1 PVA固定化顆粒的制備

將1.5%海藻酸鈉與10%的PVA混合，微波爐加熱使其完全溶解，冷卻后加入OD600為1.2的菌懸液混合均勻，用20 mL注射器將其滴入飽和硼酸溶液中交聯2 h，再轉移至1 mol/L的Na2PO4溶液中繼續交聯2 h，得到白色有彈性的固定化顆粒，然后用生理鹽水清洗2次后可長時間保存在冰箱中備用。

1.2.2海藻酸鈉固定化顆粒的制備

取2%的海藻酸鈉加熱溶解，冷卻后加入OD600為1.2的菌懸液，用玻璃棒攪動液體使細菌充分散開，用20 mL注射器將溶液逐滴加入2% CaCl2溶液中進行交聯，8 h后過濾取出，用生理鹽水洗凈備用。

1.2.3明膠固定化顆粒的制備

將12%的明膠溶液加熱溶解，冷卻至室溫后加入OD600為1.2的菌懸液混合均勻，將液體石蠟置于冰浴中，再將明膠溶液用注射器滴入液體石蠟中形成小球，待小球成型后過濾將其置于0.5%戊二醛中交聯2 h。

1.2.4不同固定化載體對偶氮染料降解效率的對比

取100 mL三角瓶，裝入50 mL的LB培養基后進行高壓蒸汽滅菌，冷卻后向瓶中加入2.5 mL配制好的甲基紅染液，使體系中的染料質量濃度為100 mg/L；再取海藻酸鈉、PVA、明膠固定化顆粒分別加入降解體系中。將以上降解體系置于37℃恒溫培養箱中震蕩培養，每2 h測定吸光度，繪制降解曲線。

1.2.5固定化顆粒的連續使用能力測定

向50 mL的LB培養基中加入2.5 mL甲基紅染液使體系中染料質量濃度為100 mg/L，再加入制作好的PVA固定化小球。另做對照組，向LB培養基中加入2.5 mL染料，并加入OD600為1.2的等量游離菌液。將降解體系置于37℃恒溫培養箱中，測定染料完全降解后的吸光度和所需的降解時間。待降解反應進行完全后，測定游離菌試驗組中的吸光度，并將OD600值調至1.2，再加入等體積的染料進行第2次反應；試驗組中則直接過濾出固定化顆粒加入新的降解體系中進行反應。連續該步驟直至降解反應無法繼續進行，比較固定化顆粒和游離菌的連續使用能力。

1.2.6固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對比

配制NaOH和HCl母液，備用。將LB培養基高壓滅菌，加入等量染料溶液使反應體系染料終質量濃度為100 mg/L，同時加入等量固定化顆粒。用pH計調整反應體系酸堿度，使其分別為2，12。將以上反應體系置于37℃恒溫培養箱中震蕩培養，每6 h測定吸光度，檢驗染料降解效果。

1.2.7固定化顆粒在不同溫度條件下的降解能力對比

將LB培養基進行高溫滅菌處理，加入等量的固定化顆粒以及終質量濃度為100 mg/L的甲基紅染料。分別將以上降解體系置于恒溫培養箱中，并設定降解溫度別為10，20，30，40，50℃進行振蕩培養，測定各體系中的降解率。

2　結果與分析

2.1同固定化載體對偶氮染料降解效率的對比結果

由于不同固定化載體之間的材質不同，所形成的固定化孔隙不同，對細菌的包埋能力和強度不同，且染料溶液在其內部的擴散性能不同，因而造成了使用不同包埋劑制成的固定化顆粒對染料降解速率的不同。

不同固定化載體對偶氮染料降解效率的對比見圖1。

圖1　不同固定化載體對偶氮染料降解效率的對比

由圖1可見，以游離細菌作為對照，各試驗組的降解率差別很大。其中，游離細菌試驗組僅經過6 h染料降解率就可達到88%以上，降解體系中無肉眼可見的紅色。其他試驗組中以PVA組的降解效果最為顯著，幾乎達到了與對照組相同的速度，說明PVA對細菌能起到很好的包埋效果，對微生物的毒害作用小，且對介質的通透性良好。海藻酸鈉組的降解效果次于PVA組，8 h后的降解率也達到87%以上。作為一種天然提取物包埋劑，其固定化效果很好，球型完整均勻且無黏連現象，適于用作固定化的載體，可在固定方法上加以優化，以提高其降解速率。明膠組的染料降解試驗結果不理想，8 h后降解率仍未達到50%，且其固定化方法較為復雜，需要使用戊二醛等化學試劑，對人體有害。盡管其球型較好，但硬度不夠、黏連現象較為嚴重。某些細菌可以以明膠為食，固定化顆粒后期可能出現破裂現象，總體來看不適宜用作細菌固定化材料。綜上，本研究后續進展均采用PVA作為固定化載體。

2.2定化顆粒的連續使用降解能力測定結果

固定化包埋細菌的優勢在于其方便回收和可重復利用的性質，因此連續投加試驗的結果可以反應其在實際應用中的性能以及相對游離細菌的巨大優勢。

游離H10菌的連續使用能力測定結果見表1。

表1　游離H10菌的連續使用能力測定結果

由表1可見，游離細菌僅在第1次的試驗中將甲基紅降解了83%以上，為了保證試驗的準確性，在每次連續投加染料之前都重新調整菌液的OD值，以保證加入的細菌數量一致。而在第2次試驗中，游離細菌已經發生了部分退化，6 h后肉眼可見仍有甲基紅未被降解，16 h后測定的降解率為78%。第3次降解試驗在20 h后降解率為83%，此時容器中的菌液顏色已由初始的乳白色變暗，表示細菌發生了比較嚴重的退化。第4次連續降解試驗將降解時間延長至24 h，降解率僅為46%。

PVA固定化顆粒連續使用降解能力測定見圖2。

圖2　PVA固定化顆粒連續使用降解能力測定

由圖2可見，以PVA作為固定化載體的試驗組在連續使用8次以后仍具有較強的降解能力，在降解時間為6 h的條件下降解率始終在80%～90%，且連續使用8次之后固定化顆粒無明顯變化，球型完整無破裂。值得注意的是，降解率在前5次連續降低之后，出現輕微回升，考慮是否因為細菌在固定化顆粒內部可以進行增殖，使顆粒內部細菌數量上升導致降解速率的加快。這個觀點有待于后續試驗的進一步證實。

結果證明，本研究所制成的固定化小球極為耐用。郭建博等人曾研究指出，利用海藻酸鈣方法制成的小球在連續使用4次后，其加速降解反應的能力開始減小，并且隨著連續使用次數的繼續增加，海藻酸鈣小球的強度也會開始降低。而本試驗中使用PVA方法制成的固定化顆粒在連續使用了8次之后依然具有很強的降解能力，且在此過程中PVA小球的球型一直保持完整，顯示出了PVA作為固定化載體相對于游離細菌在連續使用能力上的巨大優勢，適于在實際工業生產當中應用。

2.3定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對比結果

為了檢驗固定化顆粒在極端pH值條件下的降解能力，本研究測定了pH值梯度對固定化顆粒的影響。

固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對比見圖3。

圖3　固定化顆粒在pH值梯度條件下的降解能力對比

由圖3可見，PVA固定化顆粒在pH值為5～9均具有良好的降解效果，都能達到最終66%以上的降解率。其中，在降解體系的pH值為6時的固定化顆粒對染料降解速率最快，6 h的降解率為84.53%；而pH值小于5和pH值大于9的部分均未能對染料進行有效降解，因此未在圖3中顯示其結果。然而，在pH值2～11時，反應體系中的PVA固定化顆粒均未發生溶解、破裂等現象，因此可知PVA材料有較強的耐酸堿性，適合用于各種pH值條件。圖3中降解速率產生差別原因在于，極端pH值條件下細菌產生的酶活性受到影響，進而影響了染料降解。

2.4定化顆粒在不同降解溫度條件下的降解能力對比結果

降解溫度梯度試驗檢驗了PVA固定化顆粒在不同降解溫度中對染料的降解能力，對實際應用具有重要的意義。

固定化顆粒在不同降解溫度下對偶氮染料的降解率見圖4。

圖4　固定化顆粒在不同降解溫度下對偶氮染料的降解率

由圖4可見，包埋菌的最適降解溫度為40℃左右，該條件下6 h的降解率可以達到69.26%；其余降解溫度試驗組的降解率均在28.91%以下。而當降解時間延長至24 h之后，40℃以下試驗組的降解率均有了很大的提高，只有50℃環境試驗組沒有繼續降解。推測細菌所產生的偶氮染料還原酶在高溫條件下發生失活，而在6 h以內，固定化顆粒內部處于溫度上升期，細菌所產生的酶未達到失活溫度之前進行了一部分降解；當降解溫度達到50℃以后，酶失活導致染料不再發生降解。

另外，在50℃的試驗組中，可以觀察到PVA固定化顆粒的體積有了明顯增大，小球外表不再呈現乳白色，產生了透明效果；其他降解溫度試驗組中PVA顆粒沒有明顯的體積變化。據此推測，高溫可能會對固定化載體的材料產生一定影響，不同材料可以耐受的最高溫度不同，在實際應用中可以根據不同的降解溫度環境選擇不同種類的載體材料。

3　結論

本研究利用載體包埋的方法對偶氮染料降解菌株H10進行固定化處理，并對固定化后得到的顆粒進行了一系列試驗測定其降解能力，試驗結論如下。

在載體選擇上使用PVA作為包埋劑得到的固定化顆粒球型好，孔隙大小適宜，可以在固定住細菌的同時使染料分子、酶類及其他生物代謝產物自由通過，可多次連續使用且對微生物無毒害作用。PVA固定化顆?？梢阅褪躳H值2～11的極端酸堿環境，且當反應體系pH值在5～9時，固定化顆粒中的細菌可對染料進行降解，其中最佳pH值為6；過高或過低的降解溫度均會對細菌活性產生影響，進而影響染料降解速率，因此試驗測定固定化顆粒在37℃附近有著最佳的降解效果，PVA固定化顆粒在50℃以下的環境中均保持穩定，在50℃時體積開始發生膨脹、顏色變透明、孔隙變大，據此推測PVA作為包埋劑的固定化顆粒不適于在高溫下作業。在pH值、降解溫度條件均為最優的情況下，PVA固定化顆?？梢栽诒３智蛐屯暾那闆r下連續使用8次以上，在實際應用中具有重要的意義。

參考文獻：

[1]王侃，陳英旭，葉芬霞.SiO2負載的TiO2光催化劑可見光催化降解染料污染物[J].催化學報，2004，25（12）：931-936.

[2]Rott U，Minke R.Overview of wastewater treatment and recycling in the textile processing industry[J].Water Science & Technology，1999，40（1）：137-144.

[3]梁宏，曾抗美.染色廢水處理方法的研究進展[J].四川輕化工學院學報，2003，16（2）：20-24.

[4]鐘金湯.偶氮染料及其代謝產物的化學結構與毒性關系的回顧與前瞻[J].環境與職業醫學，2004，21（1）：58-62.

[5]薛方亮，張雁秋.染料廢水處理技術最新研究進展[J].水科學與工程技術，2007（2）：26-29.

[6]Liu J，Liu H.Degradation of azo dyes by algae[J].Environmental Pollution，1992，75（3）：273-278.

[7]張蔚文，張灼.固定化微生物技術在廢水處理中的應用與研究[J].上海環境科學，1991（10）：20-24.

[8]蔣宇紅，黃霞，俞毓馨.幾種固定化細胞載體的比較[J].環境科學，1993（2）：11-15.

The Application of Immobilization Method in Degradation of Azo Dye Wastedwater

ZHANG Hao，CUI Daizong，ZHANG Miao，*ZHAO Min
（Department of Microbiology，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China）

Abstract：In this study，a strain of azo dyes degradation bacteria is immobilized in the PVA granular.The degradation characteristics are investigated by measuring the decolorization rate of azo dyes in aerobic conditions.The results indicate that PVA granular has better performance in shape，stability and dispersity compared with gelatin and sodium alginate granular.The decolorization results indicate that PVA granular can make the best effect of decolorization at 40℃and pH 5～6.Meanwhile，the granular can support more decolorization cycles compare with dissociative bacteria，it can maitain intact spherical continuous use for more than 8 times，which has a significant values in practical industries.

Key words：immobilization；PVA；azo dyes；microbial degradation

中圖分類號：TQ613.1

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.038

文章編號：1671-9646（2016）02b-0034-04

收稿日期：2015-12-11

作者簡介：張昊（1990—），男，碩士，研究方向為環境微生物。

*通訊作者：趙敏（1964—），男，博士，教授，研究方向為環境微生物。