利妥昔單抗對CIK細胞殺傷活性及細胞毒作用的影響

李青，鄧琦，趙明峰，李玉明(1天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津300070；天津市第一中心醫(yī)院)

?

利妥昔單抗對CIK細胞殺傷活性及細胞毒作用的影響

李青1,2，鄧琦2，趙明峰2，李玉明2(1天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津300070；2天津市第一中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察利妥昔單抗對細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞殺傷活性及細胞毒作用的影響，為利妥昔單抗的臨床應用提供依據(jù)。方法取15例健康供者外周血制備CIK細胞，分為對照組、觀察1組、觀察2組。觀察1組、觀察2組分別加入5×104、10×104 μg/L的利妥昔單抗，對照組不加入利妥昔單抗。干預第14天時，以流式細胞儀檢測CIK細胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表達，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)水平，以流式細胞儀檢測CIK細胞表面活化性受體NKG2D(CD314)及CIK細胞中顆粒酶B、穿孔素的表達。將每組CIK細胞復設3孔，分別與髓系白血病細胞株K562和B細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL2以10∶1、20∶1、40∶1共培養(yǎng)，采用MTT法測定各組對K562細胞及SU-DHL2細胞的殺傷活性。結果各組CD3+、CD3+CD56+表型差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。觀察1組、觀察2組細胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于對照組(P均<0.05)。觀察1組、觀察2組CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、穿孔素的表達均高于對照組(P均<0.05)。各組CIK細胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時對K562細胞、SU-DHL2細胞的殺傷活性均高于對照組(P均<0.05)。結論利妥昔單抗可增強CIK細胞的殺傷活性，對髓系白血病細胞及B細胞淋巴瘤細胞均具有細胞毒作用。

關鍵詞：利妥昔單抗；細胞因子誘導殺傷細胞；白血??；淋巴瘤

急性白血病(AL)完全緩解后體內的殘留病灶是導致AL復發(fā)的根源。利用具有殺傷腫瘤細胞活性的免疫活性細胞清除AL殘留病灶，是預防AL復發(fā)的重要方法。細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞是一組CD3+CD56+細胞，同時具有T細胞的抗瘤活性和NK細胞的非主要組織相容性復合體(MHC)限制性殺瘤特點，是目前血液腫瘤生物免疫治療中應用最廣泛、最具有發(fā)展前景的細胞之一[1]。CIK細胞可分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、IL-2等具有細胞殺傷作用的細胞因子，其細胞表面活化性受體NKG2D(CD314)也具有殺傷活性。如何提高CIK細胞的殺瘤活性是提高其臨床應用效果的必要前提。利妥昔單抗是人-鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體，對于B細胞淋巴瘤具有較好的療效[2～5]。目前，對利妥昔單抗是否可影響CIK細胞對AL細胞的殺傷能力尚不明確。2014年10月～2015年10月，我們應用利妥昔單抗干預CIK細胞，觀察對CIK細胞的殺傷活性及細胞毒作用的影響，為利妥昔單抗的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞及試劑髓系白血病細胞株K562和B細胞淋巴瘤細胞株SU-DHL2為本實驗室保存。重組人白細胞介素2(rhIL-2)、IFN-γ購自北京四環(huán)生物制藥公司；CD3單克隆抗體購自北京同立海源生物科技有限公司；利妥昔單抗購自上海羅氏制藥公司；FITC標記的鼠抗人CD3、CD56及同型對照購自美國BD公司；PE標記NKG2D(CD314)購自美國Biolegend公司；PE標記穿孔素、顆粒酶B購自美國Biolegend公司。

1.2外周血CIK細胞制備取15例健康供者外周血各20 mL，作為體外培養(yǎng)的CIK細胞來源。肝素抗凝，經Ficoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用完全培養(yǎng)液(含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)懸浮，調整細胞密度為1×105/mL備用。

1.3分組及干預方法取6孔培養(yǎng)板，將CIK細胞以1×106/孔培養(yǎng)，分為對照組、觀察1組、觀察2組。各組加入1×106U/L的IFN-γ后，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后再加入1×106U/L的IL-2、50 μg/L的CD3單抗，觀察1組、觀察2組再分別加入5×104、10×104μg/L的利妥昔單抗。對照組不加入利妥昔單抗干預。

1.4CIK細胞表型檢測干預第14天時收集2×105個細胞，以流式細胞儀檢測CIK細胞免疫表型CD3+、CD3+CD56+的表達，評價利妥昔單抗干預后CIK細胞表型的變化。

1.5細胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平檢測干預第14天時取各組上清，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清液中TNF-α、IFN-γ水平，評價CIK細胞分泌具有殺傷效應細胞因子的功能。

1.6CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、穿孔素檢測干預第14天時，收集2×105個細胞，以流式細胞儀檢測CIK細胞表面CD314的表達，檢測CIK細胞中顆粒酶B、穿孔素的表達，評價CIK細胞的殺傷活性。

1.7細胞毒作用觀察采用MTT法。取96孔培養(yǎng)板，將每組CIK細胞復設3孔，分別與K562細胞以10∶1、20∶1、40∶1進行共培養(yǎng)，另設CIK細胞對照孔、K562細胞(靶細胞)對照孔。同法處理SU-DHL2細胞。孵育72 h后，離心去上清，加入MTT試劑20 μL(50 g/L)，加入二甲基亞砜150 μL，酶聯(lián)免疫檢測儀(波長570 nm)檢測吸光度(OD)值，重復測3次取均值,計算殺傷活性。殺傷活性(%)=[1-(OD實驗孔-OD細胞對照孔)/OD靶細胞對照孔]×100%。

2結果

2.1各組CIK細胞CD3+、CD3+CD56+表達比較各組CD3+、CD3+CD56+表達差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　各組CIK細胞CD3+、CD3+CD56+表達比較

2.2各組細胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平比較觀察1組、觀察2組細胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平均高于對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組細胞上清液TNF-α、IFN-γ水平比較(ng/L)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3各組CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、穿孔素表達比較觀察1組、觀察2組CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、穿孔素的表達均高于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3　　　　各組CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4各組CIK細胞對K562、SU-DHL2細胞的殺傷活性比較各組CIK細胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時對K562細胞、SU-DHL2細胞的殺傷活性均高于對照組(P均<0.05)。見表4、5。

表4　各組CIK細胞對K562細胞殺傷活性比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

表5　　　　各組CIK細胞對SU-DHL2細胞殺傷活性

注：與對照組比較，*P<0.05。

3討論

AL和惡性淋巴瘤復發(fā)是導致治療失敗及患者死亡的根本原因，清除殘存的腫瘤細胞是患者緩解后治療的主要目的。CIK細胞在體外及體內均具有良好的抗腫瘤活性，廣泛應用于生物免疫治療領域。但血液系統(tǒng)腫瘤由于存在免疫編輯作用，加之多療程化療對患者正常T細胞功能存在抑制作用，可導致患者的CIK細胞增殖能力及殺傷效應降低[6,7]，進而影響生物治療的效果。血液腫瘤患者的CIK細胞活性降低與腫瘤早期復發(fā)相關，因此，提高CIK細胞殺傷效應可提高生物免疫治療的效果，更好地清除殘留病灶、預防復發(fā)、延長患者生存期。

利妥昔單抗是以基因工程研制的高純度部分可變區(qū)(R)為鼠源，其他部分和恒定區(qū)為人源的人鼠嵌合型單克隆抗體，其主要靶點為B細胞表面CD20抗原，廣泛應用于B細胞淋巴瘤的治療。利妥昔單抗可與B細胞的CD20抗原結合，直接誘導B淋巴細胞瘤凋亡，其機制可能為通過抗體依賴細胞介導細胞毒效應(ADCC)和補體依賴的細胞毒效應(CDC)效應殺傷腫瘤細胞[8]。此外，利妥昔單抗可通過ADCC效應促進單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等釋放穿孔素、顆粒酶B、TNF-α等，發(fā)揮殺傷靶細胞作用。但利妥昔單抗是否可增強CIK細胞的活性尚不清楚。CD3+CD56+是CIK細胞的表型，對于殺傷作用的發(fā)揮具有主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，各組CIK細胞CD3+、CD3+CD56+表達差異無統(tǒng)計學意義，提示利妥昔單抗干預CIK細胞后對細胞的表型無明顯影響，仍保留CIK細胞的殺傷作用。

CIK細胞可分泌多種細胞因子。CIK細胞分泌的TNF-α、IFN-γ不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過調節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應間接殺傷腫瘤細胞[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組、觀察2組細胞上清液TNF-α、IFN-γ水平均高于對照組，提示利妥昔單抗干預CIK細胞后，可增加CIK細胞分泌TNF-α、IFN-γ等細胞因子的功能，從而增強CIK細胞的抗腫瘤作用。

CD314是介導CIK細胞殺傷活性的主要活化性受體，也是腫瘤細胞與CIK細胞發(fā)生免疫編輯的靶點[11,12]。腫瘤患者體內的CIK細胞受腫瘤細胞的編輯，使表面活化性受體CD314表達下降，導致CIK細胞的殺傷活性降低。顆粒酶B、穿孔素存在于CIK細胞的胞質中，是細胞毒效應分子，可直接活化凋亡蛋白酶進而誘導靶細胞的凋亡。此外，顆粒酶B還可以通過甘露糖-6磷酸受體介導的胞吞作用攝入靶細胞，經穿孔素作用破壞靶細胞的核內膜，進而通過線粒體途徑誘導靶細胞的凋亡，是CIK細胞發(fā)揮殺傷作用的主要效應分子[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察1組、觀察2組CIK細胞表面CD314及細胞中顆粒酶B、穿孔素的表達均高于對照組，提示利妥昔單抗增加了CIK細胞表面CD314的表達，增加了細胞中顆粒酶B、穿孔素的釋放，從而增強了殺傷活性，可能與利妥昔單抗抑制CIK細胞的免疫編輯作用有關。

利妥昔單抗作為B細胞表面標志物CD20的單克隆抗體，對于B細胞淋巴瘤的治療具有特異性效果。本研究發(fā)現(xiàn)，各組CIK細胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時對SU-DHL2細胞的殺傷活性均高于對照組，提示利妥昔單抗干預CIK細胞后，提高了對B細胞淋巴瘤細胞的殺傷活性，可能與利妥昔單抗的直接殺傷作用有關，也可能與利妥昔單抗提高CIK細胞的殺傷活性有關；各組CIK細胞在10∶1、20∶1、40∶1效靶比時對K562的殺傷活性也高于對照組，提示雖K562細胞表面CD20抗原表達較低，但CIK細胞對其的殺傷作用仍增強，考慮雖利妥昔單抗是抗CD20單抗，也可增強對不具有CD20抗原的髓系白血病細胞的細胞毒作用，表明利妥昔單抗既可以殺傷髓系白血病細胞，也可以殺傷B細胞淋巴瘤細胞，可能不僅通過CD20靶點發(fā)揮作用，也可能與增強CIK細胞分泌TNF-α、IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素等從而增強CIK細胞的殺傷活性有關。

參考文獻：

[1] Pievani A, Borleri G, Pende D, et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity[J]. Blood，2011,118(12):3301-3310.

[2] 朱雄增,李小秋.解讀2008年惡性淋巴瘤WHO分類——霍奇金淋巴瘤及其他[J].臨床與實驗病理學雜志,2010,26(5):515-517.

[3] Pfreundschuh M, Kuhnt E, Trimper L, et al. CHOP-like chemotherapy with or without rituximab in young patients with good-prognosis diffuse large-B-cell lymphoma：6-year result so of an open-label randomised study of the Mab Thera International Trial (MlnT) Group [J]. The lancet Oncol, 2011,12(11):1013-1022.

[4] Fowler N, Kahl BS, Lee P, et al. Bortezomib, bendamustine, and rituximab in patients with relapsed or refractory follicular lymphoma: the phase Ⅱ VERTICAL study[J]. J Clin Oncol, 2011,29(25):3389-3395.

[5] Wierda WG, Padmanabhan S, Chan GW, et al. Ofatumumab is active in patients with fludarabine-refractory CLL irrespective of prior rituximab：results from the phase 2 international study[J]. Blood, 2011,118(19):5126-5129.

[6] Richards JO, Chang X, Blaser BW, et al. Tumor growth impedes natural-killer-cell maturation in the bone marrow[J]. Blood, 2006, 108(1): 246-252.

[7] Colucci F, Caligiuri MA, Santo JP. What does it take to make a natural killer[J]. Nat Rev Immunol, 2003,3(5):413-425.

[8] Alice P, Camilla B, Christian K, et al. Enhanced killing of human B-cell lymphoma targets by combined use of cytokine-induced killer cell (CIK) cultures and anti-CD20 antibodies[J]. Blood，2011,117(2):510-518.

[9] Tsuda H, Sakai M, Michimata T, et al. Characterization of NKT cells in human peripheral blood and decidual lymphocytes[J]. Am J Reprod Immunol, 2001,45(2):295-302.

[10] Romagnani S. T-cell subsets (Th1 and Tp) [J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2000,85(1):9-18.

[11] González S,López-Soto A, Suarez-Alvarez B, et al．NKG2D ligands：key targets of the immune response[J].Trends Immunol, 2008,29(8):397-403．

[12] Wiemann K, Mittrficker HW, Feger U, et al. Systemic NKG2D down．regulation impairs NK and CD8 T cell responses vivo[J].J Immunol, 2005,175(2):720-729．

[13] Verneris MR, Kornacker M, Mailander V, et al. Resistance of ex vivo expanded CD3+CD56+T cells to Fas-mediated apoptosis [J]. Cancer Immunol Immunother, 2000,49(6):335-345.

[14] Metelitsa LS, Naidenko OV, Kant A, et al. Human NKT cells mediate antitumor cytotoxicity directly by recognizing target cell CD1d with bound ligand or indirectly by producing IL-2 to activate NK cells[J]. J Immunol, 2001,167(6):3114-3122.

Effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer cells

LIqing1,DENGQi,ZHAOMingfeng,LIYuming

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of rituximab on killing activity and cytotoxicity of cytokine-induced killer (CIK) cells and to provide basis for the clinical application of rituximab.MethodsCIK cells from peripheral blood of healthy donors were prepared and then were divided into the control group, observation group 1 and observation group 2. The observation group 1 and observation group 2 were respectively added with 5×104, 10×104 μg/L rituximab and the control group was not treated. On day 14, the expression of CD3+, CD3+CD56+ was analyzed by flow cytometry, the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon γ (INF-γ) were detected by enzyme-linked immunosorbent method, and the expression of CD314, granzyme B and perforin in the CIK cells of the three groups was detected by flow cytometry. In the three groups, three holes of CIK cells were reset to co-culture with K562 cells and SU-DHL2 cells with the ratios of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1), and then the cytotoxicity of the CIK cells against K562 or SU-DHL2 cell lines were measured using MTT. Results The phenotypes of CD3+, CD3+CD56+ had no statistical difference among these three groups (P>0.05). The levels of INF-γ and TNF-α in the supernatant of the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (P<0.05). The expression of CD314, granzyme B and perforin in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). Cytotoxicity against SU-DHL4 or K562 cells at different ratio of E/T (10∶1, 20∶1 and 40∶1) in the observation group 1 and observation group 2 were higher than that of the control group (all P<0.05). ConclusionRituximab can improve the killing activity of CIK cells and has cytotoxic effect on the myeloid leukemia cells and B-lymphoma cells.

Key words:rituximab; cytokine-induced killer cells; leukemia; lymphoma

(收稿日期：2015-12-09)

中圖分類號：R733.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0021-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.007

通信作者簡介：趙明峰(1971-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤免疫及造血調控。E-mail: zmfzmf@hotmail.com

第一作者簡介：李青(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向為惡性血液病系統(tǒng)診治。E-mail: 15522388022@163.com

基金項目：天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(2014KZ021)；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點攻關項目(13KG106)。