外源性瘦素預防糖尿病大鼠呼吸機相關性肺損傷機制探討

張愛民，蔣宗濱，李燕堯，陳云婷(廣西醫科大學，南寧530007；廣西醫科大學第一附屬醫院)

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·基礎研究·

外源性瘦素預防糖尿病大鼠呼吸機相關性肺損傷機制探討

張愛民1，蔣宗濱2，李燕堯2，陳云婷2(1廣西醫科大學，南寧530007；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

摘要：目的探討外源性瘦素對糖尿病大鼠呼吸機相關性肺損傷(VILI)的保護機制。 方法選擇Wistar大鼠40只，取其中30只制備2型糖尿病模型并分為B、C、D組各10只，其余10只未造模大鼠為A組。造模后各組腹腔注射麻醉，氣管切開并插管，A、B組帶管自主呼吸，C組應用40 mL/kg潮氣量行呼吸機機械通氣4 h，D組經氣管插管滴注外源性重組瘦素50 μg/kg后，應用40 mL/kg潮氣量行呼吸機機械通氣4 h。機械通氣結束后，處死各組大鼠，取出肺臟，測定濕干比(W/D)，HE染色法觀察肺組織病理改變并進行病理評分，免疫組化法檢測肺組織瘦素及瘦素受體(OB-Rb)蛋白表達，ELISA法檢測肺組織勻漿中白細胞介素1β(IL-1β)、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細胞炎癥蛋白2(MIP-2)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結果C、D組W/D、肺組織病理評分均高于A、B組，D組W/D、肺組織病理評分、瘦素、OB-Rb蛋白表達均低于C組(P均<0.05)。D組肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2、MPO水平及肺組織瘦素、OB-Rb表達均低于C組(P均<0.05)。結論外源性瘦素預處理可明顯減輕糖尿病大鼠VILI，其機制可能與抑制內源性瘦素水平及肺組織炎癥反應有關。

關鍵詞：呼吸機相關性肺損傷；糖尿病；瘦素；瘦素抵抗；炎癥

糖尿病常引起全身多器官損害，肺臟是主要的損傷部位之一，可導致肺組織炎性細胞浸潤[1]、通氣功能與彌散功能下降[2]，出現代謝源性肺功能異常。當糖尿病患者出現呼吸功能衰竭需行呼吸機治療時，往往可導致其肺損傷進一步加重，出現呼吸機相關性肺損傷(VILI)，表現為肺組織炎癥反應、透明膜形成、血管通透性增加及肺水腫。瘦素是由脂肪組織分泌的神經肽類物質，在能量平衡、脂類代謝、胰島素分泌等機制中發揮重要作用[3]。近年研究發現，瘦素預處理可有效抑制急性肺臟缺血梗死后的炎癥因子水平，對肺組織發揮保護作用[4]。但外源性瘦素預處理是否能有效抑制糖尿病VILI尚不明確。2014年3～7月，我們對糖尿病VILI大鼠應用外源性瘦素，探討其對VILI的保護作用機制。

1資料與方法

1.1動物與試劑清潔級Wistar大鼠40只，4周齡，體質量80～100 g(由廣西醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：SYXK 桂2014-003)。外源性重組瘦素(美國PeproTech公司)；痩素受體(OB-Rb)抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；四氧嘧啶(美國Sigma公司)；白細胞介素1β(IL-1β)、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細胞炎癥蛋白2(MIP-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)；大鼠瘦素單抗(英國ABCAM公司)；蘇木素染液(上海碧云天生物技術有限公司)。本實驗通過廣西醫科大學動物倫理委員會審核。

1.2模型制備及分組取30只Wistar大鼠，參照文獻[5]采用兩次腹腔注射四氧嘧啶法制備2型糖尿病模型。72 h后取尾靜脈血測空腹血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功。將糖尿病大鼠按隨機數字表法分為B、C、D組各10只。其余10只未造模大鼠作為正常對照組(A組)。

1.3呼吸機干預方法根據文獻[6]，各組使用6 mg/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，氣管切開并插管。A、B組帶管自主呼吸4 h，C組應用40 mL/kg潮氣量行呼吸機機械通氣4 h，D組經氣管插管滴注50 μg/kg的外源性重組瘦素后，應用40 mL/kg潮氣量行呼吸機機械通氣4 h。

1.4標本取材機械通氣結束后，頸總動脈放血處死各組大鼠，在4 ℃條件下迅速打開胸腔取出肺臟。將一部分標本-80℃凍存，另一部分標本貯存于4%甲醛，分別作肺組織勻漿和病理切片。

1.5肺組織重量測定取右肺上葉，蘸干表面水分稱濕重(W)，然后75 ℃烘烤48 h稱干重(D)，計算濕干比(W/D)，評估肺組織的水腫程度。

1.6肺組織病理觀察采用HE染色法。肺組織固定后石蠟包埋，切片行HE染色，觀察病理改變并進行病理評分。對下列四項表現進行評分：①肺泡腔充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤聚集；④肺泡壁增厚和透明膜形成。依病變輕重評分[7]，0分為無病變或輕微，1分為輕度病變，2分為中度病變，3分為重度病變，4分為極重度病變。各項分數相加作為病理評分。

1.7肺組織瘦素及OB-Rb蛋白表達檢測采用免疫組化法。組織切片后進行抗原修復，分別用瘦素單抗、OB-Rb抗體作為一抗4 ℃過夜，二抗和辣根過氧化物酶孵育后，DAB顯色、蘇木素染核，封片。用Olympus顯微鏡及顯微攝像儀對染色組織切片進行觀察。每個切片隨機取5個高倍視野，分別測定陽性顆粒的平均光密度值(IOD)作為瘦素和OB-Rb蛋白表達水平。

1.8肺組織勻漿中炎性因子檢測采用ELISA法檢測各組肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2及MPO水平。

2結果

2.1各組肺組織W/D比較C、D組W/D高于A、B組，D組W/D低于C組(P均<0.05)。見表1。

2.2各組肺組織病理改變及病理評分比較A組未見明顯肺損傷；B組有少量白細胞浸潤與炎性滲出；D組肺組織點狀出血、肺間質水腫明顯，大量炎細胞聚集，肺實變明顯；E組少量點狀出血，肺間質部分水腫與炎細胞聚集，無肺實變。各組肺組織病理評分見表1。

2.3肺組織瘦素、OB-Rb蛋白表達比較D組瘦素、OB-Rb蛋白表達均低于B、C組(P均<0.05)。見表1。

2.4肺組織勻漿中炎性因子水平比較C、D組肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2、MPO水平均高于A、B組，D組以上各指標水平均低于C組(P均<0.05)。見表2。

表1　　　　各組肺組織W/D、病理評分、肺組織瘦素

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

表2　　　　各組肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3討論

糖尿病是一類全身性的代謝性疾病，可導致多個重要器官的病變。長期高血糖可使肺功能受到損害，其肺功能損傷程度與血糖水平有關[8]，胰島素抵抗也可降低肺彌散功能[9]。隨糖尿病病程進展，肺功能損傷可能更加嚴重。糖尿病患者后期存在因呼吸功能障礙而接受呼吸機治療的可能。然而，呼吸機常會導致VILI，使肺血管通透性增加、炎性細胞積聚和細胞因子、炎癥趨化因子釋放，可進一步加重肺損傷[10]。因此，尋找減輕糖尿病患者VILI的方法，對于改善糖尿病患者應用呼吸機治療的效果、促進病情轉歸具有重要意義。

瘦素是肥胖基因的產物，除具有調控脂肪代謝和體質量外，還具有促炎、造血、促進血管生成及活性氧生成等作用。糖尿病患者體內高血糖狀態可導致脂肪-胰島素分泌軸失衡，導致高瘦素血癥。高瘦素血癥(瘦素抵抗)可促進肺內炎癥因子生成，誘導促炎性細胞因子前體向活性轉化[11]。同時，糖尿病患者呈現胰島素抵抗，胰島素抵抗可刺激瘦素基因的過度表達，使血液與組織的內源性瘦素升高，誘導體內產生胰島素抵抗，加重組織的損傷。而外源性瘦素具有與內源性瘦素不同的作用，外源性瘦素可降低內源性瘦素水平，通過脂肪-胰島素軸改善胰島素抵抗，調控胰島素敏感性，降低體內血糖水平，抑制氧化應激，從而緩解肺組織損傷，對肺組織具有保護作用。研究發現，通過外源性瘦素預處理可以有效降低肺梗死的損傷程度，提示外源性瘦素可能對肺損傷有保護作用。OB-Rb是瘦素識別并結合的主要受體，在呼吸系統的支氣管和肺泡上皮細胞、支氣管平滑肌細胞上表達豐富。瘦素通過作用于OB-Rb發揮對炎癥信號通路的調控。本研究發現，糖尿病模型大鼠W/D均大于4，提示即使未經呼吸機治療，糖尿病大鼠已經產生明顯的肺組織水腫；D組W/D、病理評分、瘦素、OB-Rb蛋白表達均低于C組，提示外源性瘦素預處理后，降低了肺部的瘦素水平、減輕了肺組織損傷，與余帆等[12]研究結果一致。OB-Rb表達量的降低，可能由于高瘦素血癥改善，伴隨體內胰島素水平發生下降，對OB-Rb的刺激作用減弱所致。

炎癥浸潤是導致肺組織病理改變的重要基礎。糖尿病大鼠的肺組織可出現炎性細胞浸潤，使肺泡上皮、肺泡上皮細胞基底膜、肺泡壁、肺泡毛細血管基底膜、支氣管基底膜、肺泡間隔增厚，導致肺間質膠原成分增多，造成呼吸功能障礙[13]。炎癥反應時，IL-1β組織水平增加，而IL-1β能夠減少趨化因子4的表達，從而提高多形核白細胞(PMN)的含量，PMN能通過活性氧、彈性水解酶等導致肺損傷。TNF-α的增加可啟動炎癥級聯反應，使MIP-2在肺內大量浸潤聚集,啟動與維持炎癥反應導致的肺損傷[14]，而MPO活性增高也可直接浸潤肺組織[15]。糖尿病出現瘦素抵抗時，體內呈現高炎癥水平。本研究發現，C組大鼠肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2及MPO等炎性因子水平高于A、B組，提示應用呼吸機后糖尿病大鼠肺組織發生炎癥反應，可能與VILI的發生有關；D組肺組織勻漿中IL-1β、TNF-α、MIP-2、MPO水平均低于C組，提示外源性瘦素預處理可明顯減輕肺組織炎癥反應，從而減輕VILI，考慮外源性瘦素減輕呼吸機對糖尿病大鼠肺功能損害的機制可能與抑制內源性瘦素水平、降低肺組織炎癥反應有關。

綜上所述，外源性瘦素預處理可明顯減輕糖尿病大鼠VILI，其機制可能與抑制內源性瘦素水平及肺組織炎癥反應有關。

參考文獻：

[1] 張宏, 白景文, 于振濤,等. 2型糖尿病患者慢性肺損傷的超微病理改變及臨床意義[J]. 解剖學報,2005,36(6):70-73.

[2] 楊海濤, 田亞強, 張光珍. 2型糖尿病患者肺功能改變及其相關因素分析[J]. 山東醫藥,2006,46(32):39-40.

[3] Hou N, Luo JD. Leptin and cardiovascular diseases[J]. Bri J Dia Vasc Dis, 2011,38(12):905-913.

[4] 姚艷敏,王希柱,宋巧鳳,等.外源性瘦素在急性肺栓塞合并肺損傷中的作用機制研究[J].中華全科醫學,2013,11(2):171-174.

[5] Ismail TA, Soliman MM, Nassan MA. Molecular and immunohistochemical effects of metformin in a rat model of type 2 diabetes mellitus[J]. Exp Ther Med, 2015,9(5):1921-1930.

[6] 武慶平, 劉萍, 王立奎, 等. 不同潮氣量通氣對大鼠呼吸機相關性肺損傷模型的影響[J].華中科技大學學報(醫學版),2006,35(4):511-514.

[7] Pastor CM, Rubbia-Brandt L, Hadengue A, et al. Role of macrophage inflammatory peptide-2 in cerulein-induced acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury[J]. Lab Invest, 2003,83(4):471-478.

[8] 周崢, 曾軍, 肖正華, 等. 2型糖尿病對肺功能的影響[J]. 中國煤炭工業醫學雜志,2005,8(6):566-567.

[9] 孫建勛, 王靜. 2型糖尿病患者肺功能變化及其影響因素[J]. 中國醫藥導報,2006,3(30):22-24.

[10] Bhattacharya S, Sen N, Yiming MT, et al. High tidal volume ventilation induces proinflammatory signaling in rat lung endothelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2003,28(2):218-224.

[11] Zarkesh-Esfahani H, Pockley G, Metcalfe RA, et al. High-dose Leptin activates human leukocytes via receptor expression on monocytes[J].J Immun, 2001,167(8):4593-4599.

[12] 余帆, 徐彤彤, 呂祥威,等. 瘦素預處理對2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 吉林大學學報(醫學版),2013,39(6):1219-1223.

[13] 穆維新, 沈亞欣, 崔士杰, 等. 2型糖尿病大鼠肺組織基質金屬蛋白酶-2、9及其抑制因子-1的表達變化[J].河北醫藥,2010,32(9):1034-1037.

[14] Pastor CM, Rubbia BL, Hadengue A, et al. Role of macrophage inflammatory peptide-2 in cerulein-induced acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury[J]. Lab Invest, 2003,83(4):471-478.

[15] Haegens A, Heeringa P, van Suylen RJ, et al. Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production[J].J Immun, 2009,182(12):7990-7996.

(收稿日期：2015-08-20)

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.008

通信作者：蔣宗濱(E-mail: jiangzongbin@hotmail.com)

基金項目：廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019137)。