糖尿病難愈性創面大鼠模型的建立

趙亞男，劉明，張玥，王彬，張玉冬，郝清智(山東中醫藥大學，濟南5004；山東中醫藥大學附屬醫院)

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糖尿病難愈性創面大鼠模型的建立

趙亞男1，劉明2，張玥2，王彬2，張玉冬2，郝清智2(1山東中醫藥大學，濟南250014；2山東中醫藥大學附屬醫院)

摘要：目的 建立一種糖尿病難愈性創面大鼠模型。方法將34只雌性Wistar大鼠隨機分為對照組和DM組各17只，適應性飼養1周后分別給予常規飼料及高脂高糖飼料喂養4周；DM組腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素，對照組腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，4周后于兩組大鼠背部制作直徑約2.5 cm的圓形創面；創面造模后第3、7、14天，觀察兩組大鼠創面愈合情況并計算創面愈合率，HE染色法觀察創面組織病理變化。結果DM組創面愈合率分別為5.21%±0.94%、31.70%±1.21%、62.20%±1.37%，對照組分別為20.87%±1.39%、49.99%±1.58%、91.60%±1.58%，兩組同時點比較P均<0.05。與對照組相比，其創面組織中含有較少的炎性細胞、纖維母細胞及新生毛細血管。結論高脂高糖飼料飼養聯合小劑量STZ注射制作2型糖尿病模型，維持高血糖4周后采用外科方法制作潰瘍模型，可成功建立糖尿病難愈性創面模型。

關鍵詞：糖尿病；潰瘍；難愈性創面；動物模型

潰瘍是糖尿病(DM)的常見并發癥之一，常遷延難愈，嚴重影響患者的病情及生活質量[1,2]。因此，從動物模型研究其發病機制十分關鍵。目前國內多以大劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)制備DM模型，并隨即制備糖尿病潰瘍(DU)模型[3,4]進行實驗研究。但該方法存在兩個問題，一是大劑量注射STZ會破壞大量胰腺細胞，引起胰島素分泌下降，與DM病理過程及臨床特征不符；二是血糖升高后尚未造成對皮膚的影響就進行潰瘍造模，與DU病理過程不符。2014年6～9月，我們采用高脂高糖飼料喂養聯合小劑量STZ腹腔注射的方法制作DM模型，并維持血糖長時間升高后再制作潰瘍模型，以期成功模擬DM難愈性創面。

1材料與方法

1.1材料清潔級雌性Wistar大鼠34只，體質量160～180 g，購自山東大學動物實驗中心；高脂高糖飼料(59%基礎飼料+20%蔗糖+18%豬油+3%蛋黃)由北京科澳協力飼料有限公司加工制作；STZ(Sigma公司，美國)；羅氏血糖儀(德國)；超低溫冰柜(725 Thermo Forma，美國)；石蠟切片機、光學顯微鏡照相系統(Lecia，德國)；CX40普通光學顯微鏡(Olympus，日本)；電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械廠)；氯仿、無水乙醇、異丙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉等(天津廣成化學試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1DM模型的建立 將大鼠隨機分為對照組和DM組各17只，適應性飼養1周后，記錄兩組大鼠的體質量、進食量、飲水量、排泄量，并斷尾取血測定大鼠隨機血糖。對照組給予普通飼料，DM組給予高脂高糖飼料。兩組均禁食12 h，DM組予1%的STZ溶液30 mg/kg單次腹腔注射，對照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后第3 天測隨機血糖≥16.67 mmol/L為DM造模成功[5]，不成功的再次空腹12 h后注射1%的STZ溶液10 mg/kg。

1.2.2DU模型的建立 維持高血糖狀態4周后，兩組腹腔注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉成功后背部脫毛，常規消毒；在背部用打孔器制作直徑約2.5 cm的圓形創面，深至皮下[6]。DU造模時兩組各死亡1只。將剩余大鼠各取15只用于后續實驗。

1.2.3創面愈合情況觀察DU造模后第0、3、7、14天，觀察創面顏色、腫脹程度、滲液量等；用數碼相機拍照，通過Photoshop軟件記算創面面積[7]。創面愈合率=(創面初始面積-給藥后第n天創面面積)/創面初始面積×100%。

1.2.4創面組織病理觀察分別于DU造模后第3、7、14 天，每組各隨機抽取5只；戊巴比妥鈉麻醉成功后，采集創面及創周2 mm的組織；4%多聚甲醛固定后，常規制成組織切片；將石蠟切片脫蠟、水化后，行HE染色，觀察創面組織病理變化。

2結果

2.1兩組DU造模后不同時點創面愈合率比較見表1。

表1　兩組DU造模后不同時點創面愈合率比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2兩組創面組織病理變化在DU造模第3天，對照組創面可見炎癥細胞浸潤明顯，有少量纖維母細胞及少量新生毛細血管；DM組創面有少量炎癥細胞、纖維母細胞及新生毛細血管；第7 天，對照組創面可見肉芽組織，纖維母細胞生長活躍，新生毛細血管數量增加，有較多炎癥細胞及少量膠原纖維；DM組創面可見炎癥細胞浸潤，有少量纖維母細胞及新生毛細血管，少量膠原纖維；第14 天，對照組創面可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細胞、纖維母細胞及毛細血管，可見較多膠原纖維；DM組創面可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細胞、纖維母細胞及毛細血管，可見膠原纖維。

3討論

目前，DM動物造模主要有以下兩種辦法：一是采用STZ或四氧嘧啶大劑量注射，此法損傷大量胰腺細胞，導致胰島素分泌顯著下降，更傾向于1型DM的特點，且動物死亡率較高[8]。二是采用高脂高糖飼料喂養聯合STZ注射[9，10]，高脂高糖喂養4周后大鼠出現明顯的肥胖和胰島素抵抗，而后一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg可成功制備2型DM模型[11～13]。因此，本研究采用第二種方法進行DM造模。

鐘清玲[14]研究發現，在大鼠DM造模成功4周后皮膚組織可出現病理性改變，而DM所致皮膚改變在DU的發生中有重要地位。陸樹良等[15]認為，DM患者表皮組織在未損傷的情況下已經存在組織學和細胞生物學行為的改變，并將此改變稱為隱性損害，認為這一隱性損害可能是DM皮膚易損或創面形成后難以愈合的重要原因之一。因此，維持DM大鼠高血糖4周后再行創面造模較之血糖升高后隨即造模更合理。本研究發現，維持高血糖4周后再行創面造模，DM組大鼠在造模后第3、7、14天創面愈合率均低于對照組，且創面組織的HE染色中表現出較少的炎性細胞、纖維母細胞及新生毛細血管等，因此本實驗成功完成了DM難愈性創面的造模。所以，高脂高糖飼料飼養聯合小劑量STZ注射制作T2DM模型，維持高血糖4周后采用外科方法制作潰瘍模型，可成功模型DM潰瘍的發病過程，并可作為DM難愈性創面的理想動物模型。

參考文獻：

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(收稿日期：2015-12-21)

中圖分類號：R332

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0031-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.010

通信作者：劉明(E-mail: liuming404@163.com)

基金項目：山東省自然科學基金資助項目(ZR2012HL14)；山東省濟南市青年科技明星計劃(20120145)。