肝移植患者術后14天內膽汁中膽汁酸水平變化及其對缺血性膽管損傷發生的預測價值

孫曉葉，康永振，沈中陽(天津市第一中心醫院 天津市器官移植重點實驗室，天津3009；天津市寶坻區人民醫院)

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肝移植患者術后14天內膽汁中膽汁酸水平變化及其對缺血性膽管損傷發生的預測價值

孫曉葉1，康永振2，沈中陽1(1天津市第一中心醫院 天津市器官移植重點實驗室，天津300192；2天津市寶坻區人民醫院)

摘要：目的觀察肝移植患者術后14天內膽汁中膽汁酸水平變化，探討其對缺血性膽管損傷(ITBL)發生的預測價值。方法選取原位肝移植手術患者39例，采用液相色譜串聯質譜法檢測術后第1、3、7、14天膽汁中6種膽汁酸水平變化，即甘氨膽酸(GCA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨酸結合脫氧膽酸(GDCA)、牛磺酸結合脫氧膽酸(TDCA)。術后隨訪3個月，以膽道造影結果為金標準判定是否發生ITBL，比較發生ITBL者(ITBL組)與未發生者(N-ITBL組)術后第1、3、7、14天各膽汁酸水平，采用ROC曲線評價各膽汁酸對術后發生ITBL的預測價值。結果術后第1天，ITBL組膽汁中GDCA水平較N-ITBL組降低；術后第7天，ITBL組膽汁中GCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；術后第14天，ITBL組膽汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；組間比較P均<0.05。ROC曲線分析顯示，術后第14天膽汁中GCDCA水平對判斷肝移植術后發生ITBL的AUC為0.751、TLCA的AUC為0.764，術后第7天GCA水平對判斷肝移植術后發生ITBL的AUC為0.717。結論肝移植術后14天內膽汁中GCDCA、GCA、TLCA水平升高，三者對肝移植患者術后3個月內發生ITBL具有預測價值。

關鍵詞：肝臟移植；膽汁酸；缺血性膽管損傷

肝移植是目前治療各種終末期肝病的重要手段，但術后易發生膽道并發癥，影響肝臟移植受者生存率和生活質量。缺血性膽管損傷(ITBL)是肝移植術后膽道并發癥的常見類型，主要指肝移植術后非吻合口部位膽管樹損傷，膽道造影顯示供體側肝內膽道擴張、狹窄，膽泥、膽石形成，甚至膽道損毀，是膽道并發癥中最難處理的類型。膽汁酸的代謝異常與多種肝膽疾病密切相關，其質和量的變化對肝膽疾病的診斷、鑒別診斷及發病機理研究具有重要價值。本研究探討肝移植患者術后14天內膽汁中膽汁酸水平變化對術后發生ITBL的預測價值。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年3月～2015年1月天津市第一中心醫院接受原位肝移植手術患者39例，男35例、女4例，年齡31～69(49.5±9.3)歲，終末期肝病模型評分(MELD評分)6～41(16.3±8.7)分，Child-Pugh分級A級7例、B級17例、C級15例，原發病為單純乙肝后肝硬化12例、乙肝肝硬化并發原發性肝癌6例、單純原發性肝癌5例、酒精性肝硬化4例、單純乙肝+丙肝后肝硬化2例、伴發原發性肝癌1例、隱源性肝硬化2例、丙肝后肝硬化2例、暴發性肝臟衰竭1例、肝血管肉瘤1例、家族性淀粉樣變1例、慢加急肝臟衰竭1例、藥物性肝損害1例。納入標準： ①年齡≥16歲；②首次接受肝移植手術；③術前原發病為非膽道疾病，排除原發性硬化性膽管炎等；④術前無膽道感染、膽道手術及膽系結石等膽道相關并發癥；⑤無不可控制的全身感染，術中留置T管；⑥術后存活3個月以上。

1.2膽汁酸檢測研究對象均于術后第1、3、7、14天常規留取膽汁5～10 mL，編號并于-80 ℃深低溫保存，3個月內分批采用液相色譜串聯質譜法測定膽汁中6種膽汁酸水平，即甘氨膽酸(GCA)、牛磺膽酸(TCA)、牛磺石膽酸(TLCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨酸結合脫氧膽酸(GDCA)、牛磺酸結合脫氧膽酸(TDCA)。上述檢測均由天津醫科大學新科技應用研究所中心實驗室完成。

1.3ITBL判定及其與膽汁酸水平的關系研究對象均進行為期3個月的隨訪觀察，去除失訪或死亡病例，以膽道造影結果為金標準判定是否發生ITBL。膽道造影具有如下改變判定為ITBL：①供體側肝內外膽管局灶或彌漫性狹窄或擴張；②肝內3級以上末梢膽管充盈不良或顯影淺淡；③肝內膽管不規則，如形態僵硬、管壁欠規整；④供體側肝內外膽管局灶或彌漫性充盈缺損影。比較發生ITBL者與未發生者術后第1、3、7、14天6種膽汁酸水平變化。

2結果

2.1肝移植術后ITBL發生情況39例肝移植手術患者均獲為期3個月的隨訪，期間共發生ITBL 11例(ITBL組)，均為男性，年齡31～60(50.5±10.1)歲，MELD評分7～20(11.9±4.5)分，Child-Pugh分級A級3例、B級5例、C級3例，原發疾病為乙肝后肝硬化4例、原發性肝癌2例、單純乙肝+丙肝后肝硬化2例、酒精性肝硬化1例、丙肝后肝硬化1例、隱源性肝硬化1例，均無肝動脈血管相關并發癥，1例存在門靜脈主干及腸系膜上靜脈狹窄合并腸系膜下動脈遠端多發動靜脈瘺。移植肝內外膽管狹窄伴擴張5例，包括左肝管狹窄2例、右肝管近端狹窄1例、左右肝管開口部同時狹窄1例、供體側膽總管閉塞伴肝內膽管明顯擴張1例；肝內膽管單發或多發充盈缺損影即膽泥形成3例，其中左肝管主干單發2例、右后肝管和左肝管起始部多發1例。膽道造影表現分支稀疏2例，移植肝肝內膽管廣泛分支稀疏1例，左、右肝管開口部顯影淺淡伴遠端分支稀疏1例；造影表現為移植肝肝內膽管形態僵硬1例，左肝管主干纖細、右肝管分支稀疏。未發生ITBL 28例(N-ITBL組)，男24例、女5例，年齡31～69(49.5～10.1)歲。

2.2ITBL組、N-ITBL組肝移植術后膽汁中膽汁酸水平比較術后第1天，ITBL組膽汁中GDCA水平較N-ITBL組升高；術后第7天，ITBL組膽汁中GCA水平、GDCA水平較N-ITBL組升高；術后第14天，ITBL組膽汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；組間比較P均<0.05。見表1。

2.3膽汁酸對診斷ITBL的價值選取表1組間比較具有統計學意義的數據，ROC曲線分析膽汁酸對ITBL發生的預測價值，結果顯示術后第14天TLCA水平對判斷肝移植術后發生ITBL的AUC及敏感性最高，術后第7天GCA水平對判斷肝移植術后發生ITBL的診斷特異性最高。

3討論

肝移植術后膽道并發癥發生率為10%～30%，其表現多樣，ITBL是其中最常見和最難處理的類型，對移植受者的危害也最為嚴重[1,2]。肝移植術后ITBL病變廣泛、病情反復，治療時間長，再次肝移植是其治療的主要方法。本研究肝移植術后ITBL發生率為28.2%， 高于以往報道[1,2]， 原因可能為我們放寬了ITBL的診斷標準，將膽道造影顯示膽道形態不規則、管壁僵硬和膽道充盈不良、分支稀疏的病例均納入到ITBL。肝移植術后早期膽道造影結果顯示，膽道形態不規則和膽道充盈不良對發生ITBL的診斷敏感度和特異度可分別高達72.22%和87.44%[3]，因此如將這部分患者排除在外將使研究的假陰性率提高。肝移植術后非吻合口部位膽泥形成可能是ITBL的繼發改變，常在膽管已有損害的基礎上發生，特別是局灶性部位膽泥進行網籃清理后常可發現膽泥形成部位伴有狹窄形成，故本研究也未將其排除在外。考慮到部分患者在膽道已有病變時可能尚未出現肝臟酶學指標或血清總膽紅素水平的升高，且肝臟酶學指標或膽紅素水平的升高受其他非膽道因素的影響較大，因此本研究對ITBL的診斷主要依靠膽道造影結果。

表1　ITBL組、N-ITBL組肝移植術后第1、3、7、14天膽汁中膽汁酸水平比較

注：與N-ITBL組同時間點比較，*P<0.05；與同組第1天比較，#P<0.05。

表2　　　　膽汁酸對肝移植術后發生ITBL預測價值的

注：臨界值為0.700。

肝移植術后發生ITBL是多因素共同作用的結果，其相關危險因素包括肝動脈血管并發癥、膽管周圍血管叢損傷[4]、灌注保存液的黏度大[5]、缺血-再灌注損傷、膽道二次熱缺血損傷、ABO血型不相容[6]、排斥反應[7]、巨細胞病毒(CMV)感染和膽汁酸鹽毒性等，涉及從供肝切取后的灌注、保存、修整到供肝植入時肝動脈吻合再到術后抗排斥和CMV感染的整個肝臟移植過程。非吻合口膽管狹窄最初被認為與肝動脈阻塞引起缺血有關，經典多型的膽道造影影像學特征有膽管狹窄、膽管擴張甚至膽管鑄型形成；而后此類病變被認定為缺血性膽管炎或ITBL，說明肝動脈血管并發癥的發生與ITBL關系密切。近年來越來越多的學者開始研究門靜脈血液供應和氧供對ITBL發生的影響并取得進展[8]。Farid等[9]研究結果提示，門靜脈血液供應在肝移植術后膽道系統血供和氧供方面具有重要的病理生理作用。本研究中11例發生ITBL患者未發現并存肝動脈血管性并發癥，僅有1例并發門靜脈主干和腸系膜上靜脈狹窄合并腸系膜下動脈遠端多發動靜脈瘺，可能與本研究樣本量少有關。

肝臟合成的膽鹽占膽汁總固體量的50%～70%。膽鹽既是膽固醇代謝的終產物，又是在細胞損傷及膽固醇、脂類、糖類代謝中活躍的信號分子。膽汁是有毒性的液體，但在生理狀態下其對肝細胞和膽管上皮的毒性作用被頂端膜高膽固醇和鞘磷脂、膽鹽微膠粒、膽汁水化或堿化等限制；此外，膽囊和較大膽管黏液形成的保護作用以及膽汁流動沖刷作用可降低膽汁與膽管上皮細胞膜頂端區域的作用時間，使膽汁的毒性作用難以顯現[10]。但是，當膽汁在肝臟-膽道之間的輸送中斷或膽汁成分比例改變、膽鹽/膽固醇失衡等均會導致膽汁毒性作用顯現并繼發肝細胞和(或)膽管損傷[11]。膽汁酸是雙親性分子，具有分子定向平衡和膠團形成兩種特殊性能，這使得其在一定范圍內(1～10 mmol/L)能夠使生物膜的磷脂和蛋白質脫落，導致膜損害，引起細胞膜通透性增加并最終導致細胞死亡。膽汁酸對生物膜影響的突出表現為其對線粒體膜通透性的影響。線粒體在細胞內環境穩定方面發揮重要作用，但在膽汁淤積時其也最容易成為膽汁酸在細胞內攻擊的靶點，成為細胞功能缺陷的始動因素。膽汁酸進入細胞后，抑制線粒體氧化呼吸化作用，使ATP合成減少，鈣泵失活；同時，因為細胞膜對Ca2+的通透性增加，細胞外Ca2+超載，激活蛋白水解酶，引起蛋白質、DNA、RNA分解，導致細胞功能失常直至死亡[12]。已有實驗證明，膽汁酸可以使體外培養的鼠肝細胞發生凋亡。Li等[13]體外培養鼠肝細胞2 h時分別將不同劑量(25、50、100、200、300 mol)的GCDCA加入培養基，結果顯示鼠肝細胞表現出典型的凋亡形態學及生化學變化，且呈濃度依賴和時間依賴效應。GCDCA引起凋亡的機制是通過配體非依賴性Fas受體激活觸發的，Caspase-8、組織蛋白酶B和蛋白激酶C參與其中[14,15]。

本研究肝移植術后14天，ITBL組肝汁中GDCA、GCA、GDCA、TLCA、GCDCA水平均較N-ITBL組升高；ROC曲線分析結果顯示，術后第14天膽汁中GCDCA水平對判斷肝移植術后發生ITBL的AUC為0.751、14天TLCA的AUC為0.764，術后第7天GCA的AUC為0.717，提示GCDCA、GCA、TLCA可能是預測肝移植患者術后3個月內發生ITBL的可靠指標，其中敏感性最高的是術后第14天膽汁中TLCA水平，特異性最高的是術后第7天膽汁中GCA水平。但由于本研究樣本量較小，在大規模樣本量研究中是否支持以上結論還需進一步研究。

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Bile acid level in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and its predictive value for occurrence of ischemic-type biliary lesions

SUNXiaoye1,KANGYongzhen,SHENZhongyang

(1TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the levels of bile acids in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and to investigate their predictive value for the occurrence of ischemic-type biliary lesion (ITBL). MethodsThirty-nine orthotopic liver transplant patients were selected. Using LC-MSMS to detect the contents of six kinds of bile acids including glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), TLCA, glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycine combined with deoxycholic acid (GDCA) and taurine combined with deoxycholic acid(TDCA) on day 1, 3, 7 and 14. They were followed up for three months after surgery, and then we determined whether ITBL occurred according to cholangiography results which served as gold standard, and compared the content of each bile acid on day 1, 3, 7 and 14 between patients with ITBL (ITBL group) and patients without ITBL (N-ITBL group). We used ROC curve to assess the predictive value of bile acids for the occurrence of ITBL. ResultsOn day 1, the content of GDCA was lower in the ITBL group than that in the N-ITBL group; on day 7, the contents of GCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group; on day 14, the contents of TLCA, GCDCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group, and significant difference was found between these two groups (all P<0.05). Analysis results of ROC carve showed that the AUC of GCDCA on day 14 for the occurrence of ITBL was 0.751, AUC of GCA on day 7 was 0.717, and AUC of TLCA on day 14 was 0.764. ConclusionThe contents of GCDCA, GCA and TLCA within 14 days after liver transplantation are increased and they all can be used as reliable indexes to predict whether ITBL occurs within 3 months after surgery.

Key words:liver transplantation; bile acid; ischemic-type biliary lesions

(收稿日期：2016-01-20)

中圖分類號：R657.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0005-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.002

通信作者簡介：沈中陽(1962-)，男，主任醫師，主要研究方向為肝臟移植。E-mail: zhongyangshen@vip.sina.com

第一作者簡介：孫曉葉(1975-)，女，副主任醫師，主要研究方向為肝臟移植。E-mail: sxy_tj@163.com

基金項目：國家高技術研究發展計劃(2012AA021001)；國家臨床重點專科建設項目(201354408)；天津市衛生局攻關項目(12KG103)。