非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達及意義

馬育華，彭海英，王志蕙，高偉，汪運山(臨沂市人民醫院，山東臨沂7600；臨沂市腫瘤醫院； 濟南市中心醫院)

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非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達及意義

馬育華1，彭海英1，王志蕙2，高偉1，汪運山3(1臨沂市人民醫院，山東臨沂276003；2臨沂市腫瘤醫院；3 濟南市中心醫院)

摘要：目的探討非小細胞肺癌組織中分化型胚胎軟骨發育基因1(DEC1)mRNA和DEC2 mRNA表達變化及意義。方法收集42例非小細胞肺癌患者的癌組織標本，28例癌旁正常組織標本；采用實時RT-PCR法檢測兩種組織標本中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA的相對表達量；分析DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達與非小細胞肺癌患者臨床病理參數的關系。結果DEC1在非小細胞肺癌組織中相對表達量為0.045 6，正常組織為0.001 7；DEC2 mRNA在非小細胞肺癌組織中的相對表達量為0.056 6，正常組織為0.000 9；兩組比較P均<0.05。DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達與非小細胞肺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度和TNM分期均無關(P均>0.05)；DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在腺癌中的相對表達量均高于鱗癌(P均<0.05)。非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達呈正相關(r=0.691，P<0.05)。結論非小細胞肺癌組織中DEC1、DEC2過表達，二者的表達變化可能參與非小細胞肺癌的發生和發展。

關鍵詞：非小細胞肺癌；分化型胚胎軟骨發育基因1；分化型胚胎軟骨發育基因2；相對定量實時RT-PCR

目前，針對細胞信號傳導通路中某些蛋白分子的靶向治療已用于肺癌患者，但治療效果個體差異較大[1]。分化型胚胎軟骨發育基因1(DEC1)和DEC2是細胞信號傳導通路中的核轉錄因子，參與細胞分化、增殖及凋亡[2]。現有研究主要集中于DEC基因在消化道腫瘤中的表達及意義，其與肺癌的關系鮮有報道。此外，目前主要采用免疫組化或Western blotting技術進行DEC1和DEC2表達的檢測，但其操作步驟繁瑣、所用單克隆抗體來源不同、檢測環境存在差異、結果判讀主觀性較強，導致結論差異較大。本研究采用相對定量實時RT-PCR方法[6]檢測非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達，探討DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在非小細胞肺癌發生、發展中的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年12月～2014年12月臨沂市腫瘤醫院收治的非小細胞肺癌患者42例，男28例，女14例；年齡43～76歲、平均60歲，其中年齡≤60歲 21例、>60歲 21例；腫瘤直徑≤3 cm 14例，>3 cm 28例；低分化20例，中高分化22例；腺癌28例，鱗癌14例；T1期17例，T2和T3期25例。42例均手術切取癌組織，28例切取癌旁正常組織(距腫瘤距離>5 cm)。

1.2癌組織及癌旁正常組織DEC1 mRNA及DEC2 mRNA表達檢測Gel Doc 1000紫外圖像分析系統。抽提組織RNA，通過核酸蛋白測量儀檢測抽提RNA的質量和濃度，要求A260/A280在1.8～2.0，并計算RNA含量。合成cDNA，反應體系20 μL，包括總RNA 2 μg、5×gDNA Buffer 2 μL、10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ Primer Mix 2 μL，加RNA free H2O至20 μL。合成的cDNA置于-80 ℃冰箱保存，統一時間進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系為50 μL，包括cDNA 2.5 μL、2×SuperReal PreMix Plus 25 μL、上下游引物各1.5 μL，加雙蒸水至50 μL。樣本DEC1、DEC2、GAPDH均平行檢測3個孔。擴增程序：95 ℃預變性15 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 DEC1引物上游為5′-TTGCTTTCCTTCCTCG-CTAC-3′，下游為5′-CACACACACCCTGAATCTGC-3′；DEC2引物上游為5′-GCCTACCGTCCCACAGATTA-3′，下游為5′-TTGGTGTCGTCTCGTTTCAT-3′。GAPDH(內參)引物上游為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。在擴增反應后繪制溶解曲線。溶解曲線顯示，DEC1、DEC2、GAPDH基因三對引物均擴增出特定單一產物，峰的形狀說明反應特異性好，峰值對應的溫度與預期產物的Tm一致。定量擴增的“S”型曲線說明反應體系的擴增效率一致。根據擴增的CT值計算ΔCT。ΔCT=CTDEC1或DEC2-CTGAPDH。通過公式2-ΔCT計算靶基因在組織中的相對表達量。分析非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA、DEC2 mRNA表達與臨床病理參數的關系及癌組織DEC1 mRNA與DEC2 mRNA表達的關系 。

1.3統計學方法采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以中位數表示，比較采用非參數檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1DEC1 mRNA及DEC2 mRNA表達DEC1在非小細胞肺癌組織中相對表達量為0.045 6，正常組織為0.001 7，兩者比較P=0.002。DEC2 mRNA在癌組織中的相對表達量為0.056 6，正常組織為0.000 9，兩者比較P=0.028。

2.2DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相對表達量與非小細胞肺癌患者臨床病理參數的關系DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相對表達量與非小細胞肺癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度和TNM分期均無關(P均>0.05)；DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在腺癌組織中的相對表達量均高于鱗癌組織(P均<0.05)。見表1。

表1　　　　DEC1 mRNA、DEC2 mRNA相對表達量與非小細胞

2.3非小細胞肺癌組織DEC1 mRNA與DEC2 mRNA表達的關系非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA和DEC2 mRNA表達呈正相關(r=0.691，P<0.05)。

3討論

在非小細胞肺癌的發生、發展過程中，細胞的信號傳導發揮重要作用。近年來研究較多的細胞信號傳導分子主要有蛋白激酶家族和核轉錄家族，蛋白激酶家族主要是酪氨酸蛋白激酶基因，核轉錄家族主要是分化型胚胎軟骨表達基因；上述基因在多種腫瘤組織中過量表達，導致過量的信號傳入細胞及細胞核內，影響細胞生長、增殖和分化。

基因表達的相對定量評估有多種方法，最常用的有擴增效率校正法和CT比較法[4]。前者通過實時PCR擴增效率和CT數值計算出相對比值，即通過S型曲線對實時PCR資料進行分析，計算PCR的擴增效率及擴增基因的估計數[5,6]。后者則假設PCR的擴增效率為1，在靶基因與對照基因擴增效率相同的情況下，直接通過公式2-ΔCT或2-ΔΔCT進行計算。在CT值比較法中，2-ΔCT和2-ΔΔCT方程式的選用應根據不同的研究目的。若檢測同一樣本經過不同處理方式對靶基因表達的影響可以選用公式2-ΔΔCT；若研究相同靶基因在不同樣本中的表達，可以選用2-ΔCT公式。本課題主要研究不同靶基因在癌組織和正常組織中的表達情況，因而采用2-ΔCT公式。

DEC1基因定位于人類染色體3p26[7]，5～7 kb，包括5個外顯子和4個內含子，啟動子區域包括多個GC盒而非TATA盒，在轉錄因子數據庫中發現其5′端區域有多個轉錄因子結合位點[8,9]。DEC1與腫瘤的關系十分密切，已經發現在乳腺癌、結腸癌、少突膠質瘤等腫瘤組織中DEC1表達升高，在血液病、結腸、肺腺癌、神經膠質細胞瘤和腎癌細胞系中也檢測到DEC1高表達[10～12]。本研究顯示，DEC1 mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達量是正常組織的26.8倍(0.045 6/0.001 7)。DEC1 mRNA在腺癌組織中的相對表達量高于鱗癌組織，但與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理分化程度和TNM分期均無關。Chakrabarti等[13]對不同乳腺組織的研究發現，從正常乳腺組織到原位癌組織、再到浸潤性乳腺癌組織，DEC1基因的表達量呈逐漸升高趨勢，并與腫瘤細胞的病理分級呈正相關。Zheng等[14]研究發現，DEC1 mRNA和蛋白在胃癌組織中表達上調，并與胃癌分化程度呈負相關。Shi等[15]研究顯示，DEC1蛋白在肝細胞癌組織中表達與其臨床分級有關，且分化程度低的腫瘤組織DEC1蛋白表達也降低。可以看出，從分子水平到蛋白水平，DEC1在不同腫瘤組織中均呈過量表達，提示DEC1在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用，但在不同組織來源的腫瘤中其表達存在異質性，即相關性的趨勢不同。產生異質性的原因可能是DEC1基因在啟動區域存在多個轉錄位點，因而在不同組織中發揮作用的機制可能不同；此外，研究方法或樣本例數不同也可造成統計學差異。

DEC2基因定位于人類染色體12p12.1-p11.23[16]，亦屬于轉錄因子，對于其在腫瘤中的作用機制存在不同學說。在某些腫瘤及腫瘤來源的細胞系中，缺氧可以上調DEC2表達[17,18]。Nakamura等[19]通過瞬時轉染技術證實，DEC2過表達可抑制人錯配修復基因MLH1的功能，即DEC2表達對腫瘤的形成存在正調控。Montagner等[20]對三陰型乳腺癌細胞系的研究證實，DEC2通過與低氧誘導因子(HIF)結合，促進HIF與蛋白酶體的相互作用，從而降解HIF。低氧是實體腫瘤物理微環境的基本特征之一，HIF是低氧環境中的重要調節因子。現有的證據表明，低氧是決定惡性腫瘤預后的重要因素。本研究顯示，DEC2 mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達是正常組織的62.9倍(0.056 6/0.000 9)。DEC2 mRNA在腺癌組織中的相對表達量高于鱗癌組織，但DEC2 mRNA表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理分化程度和TNM分期均無關。DEC2 mRNA表達變化與腫瘤的關系需進一步研究。

DEC1和DEC2均是堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)結構的轉錄因子，二者在bHLH區域和Orange區域分別有97%和52%的相似性。但是，DEC2的C-末端富含丙氨酸和甘氨酸，而DEC1無此特點，這可能是DEC2與DEC1功能不同的原因[15]。DEC1在很多組織中廣泛表達，而DEC2比DEC1的表達具有更強的組織依賴性。在心臟、骨骼肌及腦組織中，DEC2 mRNA高表達，而在肺、胎盤、胰腺和腎臟組織中其低表達。提示DEC2和DEC1在腫瘤發生、發展中可能具有不同的生物學行為[15]。本研究中非小細胞肺癌組織中DEC1 mRNA和DEC2 mRNA表達存在正相關，提示一種bHLH轉錄因子家族分子的表達直接影響另外一種分子的表達，但二者相互作用的機制還不明確。

總之， DEC1 mRNA、DEC2 mRNA在非小細胞肺癌組織中表達升高，二者的過表達可能促進非小細胞肺癌的發生、發展。

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Expression and clinical significance of DEC1/DEC2 mRNA in non-small-cell lung cancer

MAYuhua1,PENGHaiying,WANGZhihui,GAOWei,WANGYunshan

(1LinyiPeople′sHospital,Linyi276003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1 (DEC1) and DEC2 mRNA in the occurrence and development of non-small-cell lung cancer (NSCLC). MethodsForty-two cases of cancer tissue samples and 28 cases of adjacent normal tissues were collected from NSCLC patients. The relative expression levels of DEC1 and DEC2 mRNA were detected by real-time RT-PCR. The relationships between DEC1 and DEC2 mRNA and the clinicopathological characters of NSCLC patients were discussed. ResultsThe relative expression of DEC1 mRNA was 0.045 6 in the cancer tissues and 0.001 7 in the normal tissues, the relative expression of DEC2 mRNA in the cancer tissues and normal tissues was respectively 0.056 6 and 0.000 9, and significant difference was found between these two groups (all P<0.05). The expression of DEC1 and DEC2 mRNA in the NSCLC tissues was not related with gender, age, tumor diameter, differentiated degree and TNM stage (all P>0.05). DEC1 and DEC2 mRNA was expressed higher in the adenocarcinoma than that in squamous carcinoma (all P<0.05). DEC1 mRNA was positively correlated with DEC2 mRNA (γ=0.691, P<0.05). ConclusionDEC1 and DEC2 is over expressed in NSCLC tissues and its expression changes may be involved in the occurrence and development of NSCLC.

Key words:non-small-cell lung cancer; differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1; differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 2; relative quantitative real-time RT-PCR

(收稿日期：2015-08-28)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)12-0020-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.006

通信作者簡介：汪運山(1962-)，男，主任醫師，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail: sdjnwys@163.com

第一作者簡介：馬育華(1970-)，女，副主任技師，主要研究方向為免疫及分子生物學。E-mail: ma_yuhua@163.com

基金項目：臨沂市科技發展計劃項目(201313002)。