熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用

陳雪品，成曦爽，涂畫，石亞靜，呂志偉，齊亞娟,2，韓淑英,2 (華北理工大學，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重點實驗室暨唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室)

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熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用

陳雪品1，成曦爽1，涂畫1，石亞靜1，呂志偉1，齊亞娟1,2，韓淑英1,2(1華北理工大學，河北唐山 063000；2河北省慢性疾病重點實驗室暨唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室)

摘要：目的觀察熊果酸對糖尿病大鼠腎組織的保護作用。方法將45只SD大鼠隨機分為對照組(NC組，8只)、造模組(37只)。造模組以高脂飼料喂養(yǎng)4周和一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)制備糖尿病大鼠模型。將造模成功的32只大鼠隨機分為模型對照組(MC組)、二甲雙胍組(MF組)、熊果酸高劑量組(UrAH組)及熊果酸低劑量組(UrAL組)。MF組按100 mg/kg灌胃二甲雙胍，UrAH組按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL組按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC組與NC組每天灌胃同體積純水，每天1次，連續(xù)6周。分別于給藥前及給藥第2、4、6周測定各組大鼠血糖，給藥6周后測定各組大鼠血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，取雙側(cè)腎臟稱重并計算腎臟系數(shù)，釆用HE染色法在光鏡下觀察大鼠腎組織病理變化。結(jié)果與NC組大鼠相比，MC組大鼠腎組織病理損傷重，腎系數(shù)大(P<0.01)，血清UA、BUN、Scr水平高(P均<0.01)。與MC組相比，MF組、UrAH組大鼠腎臟病變減輕，腎系數(shù)小(P均<0.05)，血清UA、BUN、Scr水平低(P<0.05或<0.01)。結(jié)論熊果酸對糖尿病大鼠腎組織有一定的保護作用。

關(guān)鍵詞：熊果酸；糖尿病；糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，更是引起終末期腎臟病變的首要因素[1]。DN典型的病理特點為微循環(huán)障礙和微血管基底膜增厚[2]。在我國，糖尿病的發(fā)病率逐年上升[3]，尋求一種有效治療DN的藥物已成為研究的熱點。熊果酸是一種五環(huán)三萜酸類化合物，廣泛存在于梔子、白花蛇舌草、女貞子、山楂等藥用植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎等多種生物學效應(yīng)[4]。近年來，文獻[5]報道，熊果酸有治療糖尿病的潛在活性，并證實了熊果酸是通過保護糖尿病大鼠的胰島B細胞來降低血糖水平的。但熊果酸是否對糖尿病大鼠腎組織有保護作用尚不清楚，本實驗旨在對此進行探討。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SPF級SD大鼠45只，體質(zhì)量230～260 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。大鼠維持飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司，合格證號：SCXK(京)2014-0010。高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2014-0008。

1.2儀器與試劑羅氏血糖儀及試紙(瑞士羅氏診斷有限公司)。鏈脲佐菌素(STZ)購自西格瑪奧德里奇公司；熊果酸(中國藥品生物制品鑒定所)；鹽酸二甲雙胍片(天津亞寶藥業(yè)科技有限公司)；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)試劑盒購自北京瑞正善達生物工程技術(shù)有限公司；水合氯醛(西安藻露堂藥業(yè)集團康復醫(yī)藥有限公司)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3大鼠糖尿病模型的制備及熊果酸用法所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組(NC組，8只)、造模組(37只)。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)，所有大鼠自由飲水、進食。高脂飼料喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水16 h，造模組尾靜脈注射STZ(用pH 4.5的0.1 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉溶液配成1.5%濃度)30 mg/kg,2 mL/kg尾靜脈注射。STZ注射1周后，所有大鼠禁食不禁水12 h，取尾靜脈血檢測隨機血糖(非禁食上午8:00)，連續(xù)3次隨機血糖值≥16.7 mmol/L為造模成功。35只大鼠造模成功，剔除體質(zhì)量較低或血糖過高的3只大鼠，剩余32只，按隨機數(shù)字表法將其分為模型對照組(MC組)、二甲雙胍組(MF組)、熊果酸高劑量組(UrAH組)及熊果酸低劑量組(UrAL組)。MF組按100 mg/kg灌胃二甲雙胍，UrAH組按100 mg/kg灌胃熊果酸，UrAL組按50 mg/kg灌胃熊果酸，MC組與NC組每天灌胃同體積純水。各組均在上午8:00～10:00點灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6周。

1.4觀察方法給藥期間觀察各組大鼠一般狀態(tài)。分別于給藥前及給藥第2、4、6周用血糖儀測定隨機血糖(上午給藥后30 min)1次。給藥6周后禁食12 h，大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈取血并分離血清，靜置2 h后，3 000 r/min離心20 min，取上層血清于EP管中，并存放于-80 ℃冰箱中備用。用全自動生化分析儀測定血清UA、BUN、Scr。大鼠取血后，立即剖腹取雙側(cè)腎臟(剝離腎臟周圍脂肪)，用濾紙吸干腎臟表面血液后稱重，計算腎臟系數(shù)，腎臟系數(shù)=雙側(cè)腎臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。腎臟稱重后迅速固定于4%多聚甲醛中，取出腎臟，沖洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后，HE染色，于OLYMPUS BX50高倍顯微鏡下觀察組織形態(tài)改變并用病理圖像分析系統(tǒng)記錄和拍照。

2結(jié)果

除NC組外，其他各組大鼠自造模之日起均出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕癥狀，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)光澤度降低。各組大鼠血糖水平比較見表1。各組大鼠血清Scr、BUN、UA水平及腎臟系數(shù)比較見表2。HE染色結(jié)果顯示，NC組腎組織形態(tài)正常，腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小管排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細胞形態(tài)無異常改變。MC組大鼠腎小球體積增大，基底膜不完整；腎間質(zhì)有炎細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞明顯水腫。UrAH組腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，腎間質(zhì)僅有少量炎細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞輕度水腫。MF組腎組織病理改與UrAH組相近。UrAL組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變輕于MC組，腎間質(zhì)有散在炎癥細胞浸潤及纖維組織的增生，腎小管上皮細胞中度水腫。

3討論

高血糖是引起糖尿病微血管并發(fā)癥的根本原因,血糖控制效果不佳的患者，腎臟的病變發(fā)展相對更快[6,7]。腎臟長期處于高血糖水平，通過糖基化終末產(chǎn)物的形成，促進氧化應(yīng)激，進一步激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，導致腎組織損傷，加劇DN的發(fā)生發(fā)展[8,9]。

表1　各組大鼠血糖水平比較

注：與NC組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與MC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

表2　　　　各組大鼠血清Scr、BUN、UA水平

注：與NC組比較，△P<0.05，▲P<0.01；與MC組比較，*P<0.05，#P<0.01。

有文獻[11]指出,微炎癥狀態(tài)也與糖尿病及糖尿病腎損傷有密切聯(lián)系，尋找一種有效控制糖尿病腎損傷及其炎癥反應(yīng)的藥物，已成為臨床研究的焦點。熊果酸可改善糖尿病及其并發(fā)癥癥狀[10,11]。熊果酸可以通過增加肝糖原形成，從而降低血糖水平[12]。另外，熊果酸也能抑制糖尿病誘導腎皮質(zhì)中的誘導型一氧化氮合成酶過表達，用來治療糖尿病性腎病變[13]。因此，為進一步研究熊果酸對糖尿病大鼠腎損傷的抑制作用，我們采用30 mg/kg劑量的STZ大鼠尾靜脈注射的方法成功制備了糖尿病大鼠模型。本研究結(jié)果表明，MC組大鼠血清Scr、BUN、UA水平均升高，腎組織病變明顯，這些現(xiàn)象都說明糖尿病大鼠己出現(xiàn)早期的DN癥狀。UrAH治療組血清Scr、BUN、UA和隨機血糖均降低，腎臟系數(shù)減小，說明熊果酸可使腎組織病變減輕，從而保護受損的腎功能，延緩DN的進展。腎組織病理切片亦表明，100 mg/kg熊果酸能減輕糖尿病大鼠腎損傷，治療效果與二甲雙胍相當。

可見，熊果酸能通過降低血糖，糾正糖尿病大鼠的糖代謝紊亂，改善腎小管間質(zhì)纖維化及炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護腎臟的作用，其確切機制有待進一步研究。

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(收稿日期：2015-11-17)

中圖分類號：R587

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.010

通信作者：韓淑英(E-mail: shuyinghan59@126.com)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81471022)；國家級大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(201510081006)；華北理工大學大學生創(chuàng)新實驗計劃項目(X2015006)。