HPLC-UV切換波長法同時測定復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸

任明，許真真 (鄭州大學第二附屬醫院中藥學部，鄭州 450001)

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HPLC-UV切換波長法同時測定復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸

任明，許真真 (鄭州大學第二附屬醫院中藥學部，鄭州 450001)

摘要：目的建立同時測定復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量的評價方法。方法3批復方甘草合劑(批號：130112、130113、130201)。制備甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸混合對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液(復方甘草合劑缺甘草的陰性樣品)。采用Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，0.4%冰醋酸-甲醇梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，運用HPLC-UV切換波長法檢測3種溶液。結果甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸分別在44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4和148.40～4 452 ng范圍內線性關系良好(r分別為0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，加樣回收率分別為98.63%(RSD=1.12%)、99.13%(RSD=1.04%)、98.65%(RSD=1.06%)和99.10%(RSD=0.90%)。批號為130112的復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為67.22、17.00、24.82、2 881.93 μg/mL，RSD分別為1.32%、0.87%、2.34%、2.17%；批號為130113的復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為68.59、16.99、23.74、2 798.72 μg/mL，RSD分別為1.99%、1.33%、1.69%、1.86%；批號為130201的復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量分別為67.91、15.98、24.16、2 824.55 μg/mL，RSD分別為2.17%、2.21%、1.77%、0.97%。結論HPLC-UV切換波長法可用于同時測定復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量。

關鍵詞：復方甘草合劑；HPLC-UV切換波長法；甘草苷；異甘草苷；甘草素；甘草酸

復方甘草合劑是由甘草流浸膏、復方樟腦酊、愈創木酚甘油醚及甘油等藥物組成的中藥制劑，可祛痰鎮咳，主要用于治療咳嗽和上呼吸道感染。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸是合劑中主藥甘草的重要活性成分[1,2]。近年諸多相關研究多對甘草中甘草酸進行了含量測定，而其他成分少見報道。為更好地確定本品質量穩定性，本實驗依據相關資料[3,4]，采用高效液相色譜儀器聯用紫外檢測器通過變波長法(HPLC-UV切換波長法)對復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量進行測定，并進行相應的方法學考察，以期為該合劑的質量控制提供簡易可靠的定量評價方法。

1材料

Waters高效液相色譜儀系統(Waters2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore，美國Waters);XS105型電子分析天平;Kp200DB型超聲波清洗器;SHE-D(III)循環水式真空泵。甘草苷對照品(批號：111610-201106)購自中國藥品生物制品檢定所，甘草酸對照品(批號：1405-86-3)，異甘草苷對照品(批號：120526)和甘草素對照品(批號：100927)均購自四川成都曼思特生物科技公司；復方甘草合劑購自廣西廣明藥業(批號：130112、130113、130201)；甲醇(Fisher Scientific)，屈臣氏純凈水。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Venusil XBP-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm，博納艾杰爾)，流動相為0.4%冰醋酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脫A為50%→25%→25%→50%→50%，相應時間周期為0→15→30→35→40 min，體積流量為1.0 mL/min，紫外檢測波長為276 nm(0～12 min)、370 nm(12～23 min)、276 nm(23～40 min)，柱溫30 ℃，進樣體積10 μL。

2.2樣品溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備精密稱取甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸對照品適量置于10 mL容量瓶中，70%乙醇稀釋并定容，制成各對照品儲備液。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸質量濃度分別為221.00、223.00、171.00、742.00 μg/mL。精密量取對照品儲備液于量瓶中，70%乙醇稀釋并定容，制成混合對照品溶液，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸質量濃度分別為44.20、8.92、13.68、148.40 μg/mL。

2.2.2供試品溶液的制備精密量取復方甘草合劑1 mL，水浴蒸干，殘渣經甲醇超聲處理，功率300 W，頻率40 kHz，30 min使其溶解，放冷，收集溶解液及洗液于2 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻并濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液的制備制備復方甘草合劑缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項供試品溶液的制備方法處理得缺甘草的陰性樣品溶液。

2.3專屬性將混合對照品、陰性供試品溶液及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進行檢測。結果顯示各待測成分對應保留時間處無其他吸收峰，表明陰性無干擾。

2.4甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的線性關系精密吸取混合對照品溶液1、5、10、20、30 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定，以進樣量為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，計算回歸方程與相關系數并繪制標準曲線，結果表明甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸在檢測范圍內線性關系良好(r分別為0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，線性范圍分別為44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4、148.40～4 452 ng。

2.5復方甘草合劑穩定性試驗精密吸取新制備的同一供試品溶液(批號：130112)，于0、2、4、6、8、10、12 h進樣10 μL進行含量測定，結果顯示，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸含量分別為68.44、17.83、24.06和2 917.86 μg/mL，RSD分別為1.68%、0.87%、2.89%和2.98%。

2.6復方甘草合劑中間精密度試驗取復方甘草合劑(批號：130112)6份，分別由兩人在不同的時間按照“2.2.2”項下供試品溶液方法進行制備，注入高效液相色譜儀進行測定，結果顯示甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為68.14、16.28、24.18和2 902.40 μg/mL，RSD值分別為2.50%、0.72%、2.81%和2.65%。結果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.7復方甘草合劑重復性試驗取復方甘草合劑(批號：130112)5份，分別由兩人在不同的時間按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并進行測定，結果顯示甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為67.32、17.46、23.76和2 946.24 μg/mL，RSD值分別為1.84%、2.21%、2.82%、2.85%和2.53%。結果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.8復方甘草合劑耐用性考察對液相測定中一些變動因素進行考察。

2.8.1不同體積流量精密吸取供試品和混合對照品溶液入液相色譜儀進行含量測定，體積流量分別設定為0.8、1.0、1.2 mL/min，測得甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分別為70.42、16.66、23.92和300.24 μg/mL，RSD值分別為1.58%、1.12%、2.16%和1.97%。

2.8.2不同色譜柱精密吸取供試品和混合對照品溶液，分別使用3種不同型號的色譜柱(Agela，V9520525ck0063；Sepax,02040917032；Waters,WAT045905)進行檢測，其他按上述條件進行測定，甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸RSD值分別為1.37%、2.91%、1.36%、2.11%。

2.9復方甘草合劑加樣回收率檢測取已測得含量的復方甘草合劑樣品(批號：130112)0.5 mL共3份，按照0.5 mL樣品成分含量的80%、100%、120%分別精密加入各對照品儲備液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并進行含量測定，計算回收率。甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的平均回收率分別為98.63%、99.13%、98.65%、99.10%，RSD值分別為1.12%、1.04%、1.06%、0.90%。

2.10復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量測定取3批復方甘草合劑(批號：130112、130113、130201)，每批各3份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀進行含量測定。結果見表1。

表1　不同批號復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素、甘草酸含量及RSD

3討論

復方甘草合劑由甘草流浸膏、復方樟腦酊、愈創木酚甘油醚及甘油等藥物組成。樟腦酊則是中樞性鎮咳藥，輔料甘油有助于將藥物附于咽喉部并起到滋潤作用，尤其適用于痰多的咳嗽患者[5～9]。臨床研究[10,11]表明，服用復方甘草合劑可使患者咯痰咳嗽等癥狀和胸部體征得到明顯改善，理化檢查趨于正常。復方甘草合劑推廣多年，是經諸多臨床驗證的鎮咳藥。主藥甘草性甘、平，歸心、肺、脾、胃經，可調和諸藥，益氣補脾，祛痰止咳，清熱解毒。甘草根表皮以內部位含有的大量甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸等黃酮類物質是其重要的活性物質，具有顯著的末梢鎮咳作用，對其進行質量控制對保持復方甘草合劑臨床療效的穩定性有非常重要的作用[12～14]。

在原標準中藥品中沒有甘草流浸膏的質量控制標準，關于本品的相關研究中多對單一一種物質進行質量控制，沒有同時對這四種成分進行含量測定。本實驗參考相關資料，采用高效液相色譜儀器聯用紫外檢測器通過變波長法對這4種成分進行含量測定，并進行相應的方法學考察，以期為該合劑的質量控制提供簡易可靠的定量評價方法。甘草流浸膏中4種成分性質相似，但含量卻有較大差異。經檢測發現，甘草素、甘草酸與甘草苷在270 nm范圍處有最大吸收，而異甘草苷在360 nm處有較大吸收，吸收波長有較大差異，因此采用變波長紫外檢測器進行檢測，依據藥物保留時間變化檢測波長，能更準確地對4種物質的含量進行檢測。中藥成分多且復雜，等梯度洗脫未能獲得較好的分離效果，待測物質吸收峰易受干擾，因此選用了梯度洗脫。本研究在流動相選擇的過程中對甲醇-冰醋酸緩沖液、甲醇-水、乙腈-磷酸鹽緩沖液等流動相的洗脫進行比較，結果顯示流動相選用甲醇-0.4%冰醋酸時峰形良好且分離效果最佳。在進行系統流速考察時發現，當流速為0.8 mL/min時色譜峰偶見拖尾且洗脫時間延長，當流速為1.2 mL/min時系統壓力稍升高且待測物質色譜峰與雜質峰分離度較低，流速為1.0 mL/min時峰形良好且洗脫時間適當，因此在含量測定中選用流速為1.0 mL/min。另外，復方甘草合劑屬于中藥制劑，不同制備工藝、不同批號、不同儲存環境等因素均會對其有效成分產生一定的影響，導致含量測定結果不一樣。

本實驗采用HPLC-UV切換波長法同時測定了復方甘草合劑中甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸的含量，實驗結果表明此方法靈敏簡便、重現性好，且有較高的準確性，可為甘草合劑質量控制標準提供參考依據。

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(收稿日期：2015-08-28)

中圖分類號：R917

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0035-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.013

基金項目：河南省科技攻關計劃項目(132102310156)。