基于液相色譜-四極桿/飛行時間質譜和化學計量學的嬰幼兒配方乳粉化學指紋圖研究

林　峰，吳映璇，歐陽少倫，邵琳智，鄒　游，杜志峰

(1.廣東出入境檢驗檢疫局　檢驗檢疫技術中心，廣東　廣州　510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施

研究重點實驗室，廣東　廣州　510623;3.愛博才思亞太應用支持中心，上海　200233)

基于液相色譜-四極桿/飛行時間質譜和化學計量學的嬰幼兒配方乳粉化學指紋圖研究

林峰1,2*，吳映璇1,2，歐陽少倫1,2，邵琳智1,2，鄒游1,2，杜志峰3

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施

研究重點實驗室，廣東廣州510623;3.愛博才思亞太應用支持中心，上海200233)

摘要：在反相色譜條件下，采用液相色譜-飛行時間串聯質譜技術檢測了18種嬰幼兒配方乳粉，并應用主成分分析技術對大量的實驗數據進行統計分析處理，研究了不同數據提取參數對分析結果的影響，通過T值檢驗篩選出3種罐標顯示添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉的特征組分，提出了其中G號樣品的16個特征組分的化學信息，并構建了相關的化學指紋圖。

關鍵詞：化學指紋圖；化學計量學；液相色譜-四極桿/飛行時間質譜；嬰幼兒配方乳粉

嬰幼兒配方奶粉是乳品安全中極為重要和敏感的乳品種類，關系著下一代的健康成長。目前嬰幼兒配方乳粉的商品流通和貿易方式呈現多樣化的格局，尤其是嬰幼兒配方乳粉跨境電商貿易帶來的巨大利益，使嬰幼兒配方乳粉在該領域存在著假冒名牌的安全風險，因此需要建立一套嬰幼兒配方乳粉的鑒別、溯源檢測技術。目前對嬰幼兒配方奶粉的檢測集中在營養指標測定以及安全衛生檢測方面，難以表征產品整體特征，也得不到研究對象的特征標記物，無法達到溯源分辨的目的。因此，需要研究更為全面的嬰幼兒配方奶粉鑒別檢測技術路線。

化學指紋圖譜是一種從整體上研究復雜物質體系的技術工具，能全面反映研究對象組成成分的特征信息,采用化學指紋圖譜分析技術得到的研究對象的綜合信息,比通過單一或幾種成分測定的結果更豐富、更全面，適用于成分復雜、有效成分不明確的物質的偽劣鑒別和質量控制,是國內外普遍接受的一種質量評價模式。目前化學指紋圖譜技術主要用于中藥和天然藥物的真偽鑒別和質量控制,近年來開始應用于食品領域,包括酒類、茶葉、植物油等食品的鑒別和溯源[1-10]。以往的化學指紋圖譜研究采用的檢測技術多為傳統的單一檢測技術，所得到的數據信息量少，不能充分反映和表達檢測對象的化學特征。近年來色譜-質譜聯用技術，包括液相色譜-高分辨質譜技術開始應用于化學指紋圖譜的研究[10]，其所具有的高分離、高分辨能力可獲得研究對象更為豐富的化學信息。主成分分析(Principal component analysis ,PCA)是一種常用的化學計量學方法，目前已廣泛用于各種組學研究，將主成分分析數據處理技術應用于化學指紋圖譜的提取過程，可大大提高研究對象的化學指紋圖的特征性和有效性[1,9-16]。

嬰幼兒配方奶粉組成復雜，包括了原料乳自身含有的各種營養成分和乳粉加工過程加入的各種添加劑，同時也含有產奶動物生長飼養過程帶入或產生的化學物質(包括外源性和內源性物質)，這些化學物質提供了嬰幼兒配方奶粉的化學特征信息，足以構建能充分表征嬰幼兒配方奶粉的化學指紋圖。本文嘗試采用液相色譜-高分辨質譜檢測技術結合化學計量學數據分析技術，研究添加水解蛋白成分的嬰幼兒配方乳粉的化學成分，并構建了相關的化學指紋信息集。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AB 5600四極桿飛行時間質譜儀(美國AB Sciex公司)，配有電噴霧離子源(ESI)及島津LC-20AD液相色譜儀；3-18K高速低溫離心機(Sigma公司)。乙腈、甲酸為HPLC級，其他試劑為分析純；內標:雙氟沙星-d3,純度大于99%(WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)。

數據處理軟件：MarkerView 1.2.1.1(美國AB Sciex公司)。

1.2色譜條件

Atlantic T3柱(3 μm，150 mm×2.1 mm i.d.，Waters公司);流動相:A為5 mmol/L甲酸乙腈溶液,B為5 mmol/L甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min,5% A；1～18 min,5%～100% A；18～23 min,100% A；流速0.30 mL/min;柱溫40 ℃，進樣量5 μL。

1.3質譜條件

離子化模式：ESI(+)；一級質譜全掃描，掃描范圍：m/z100～1 000；二級質譜全掃描，掃描范圍：m/z50～1 000；霧化氣壓力379 kPa、氣簾氣壓力207 kPa、輔助加熱氣壓力448 kPa;輔助加熱氣溫度600 ℃,電離電壓:5.5 kV,去簇電壓：80 V。

1.4實驗材料

20種市售乳粉，分別以字母A～U編組(字母I除外)，其中包括18種1階段嬰幼兒配方乳粉(分別源自11個品牌或子品牌)。編號B樣品罐標顯示添加了經適度水解的乳清蛋白和酪蛋白，G樣品罐標顯示添加了部分水解牛奶蛋白,Q樣品罐標顯示添加了部分水解乳清蛋白；另2種分別為全脂乳粉、脫脂乳粉。

1.5樣品處理

稱取0.5 g試樣于50 mL 塑料離心管中(平行樣個數n=4),加入 8 mL(65±5)℃溫水，渦旋混勻2 min,加入8 mL 乙腈飽和正己烷脫脂,渦旋30 s,10 000 r/min 低溫(4 ℃)高速離心10 min,棄去正己烷層,重復脫脂1次,加入10 mL 乙腈,渦旋1 min,用乙腈-水(1∶1)定容至25 mL,混勻,以10 000 r/min 低溫(4 ℃)離心5 min,分別吸取950 μL 上清液、50 μL內標液至1.5 mL 離心管中,渦旋混勻，樣液經0.2 μm 有機濾膜過濾后上機測定。為避免儀器條件波動對結果的影響，80個樣品以隨機排列方式進樣。

1.6數據提取、過濾與分析

1.6.1數據提取測定數據全部導入MarkerView 軟件,設置色譜保留時間為0.8～24.0 min，保留時間窗5%，質量偏差窗10.0 ppm，以雙氟沙星-d3作為內標進行質譜響應強度和色譜保留時間的校正,選擇平行樣均存在(n≥3)的組分進入數據集組成，經MarkerView 軟件處理獲得80個樣品的數據集。1.6.2主成分分析對數據集不指定分組，應用MarkerView 軟件對獲得的數據集進行PCA處理；對數據集按樣品分組(同一樣品4份平行樣為1組)下進行主成分-判別分析(PCA-DA)處理。

1.6.3T檢驗分析應用MarkerView 軟件，以感興趣的某1個樣品組對其它19個樣品組進行T檢驗分析，獲得新的關注組分峰數據集，選取其中P≤0.05,log(fold change)絕對值=∞的組分峰作為該樣品初步的化學指紋圖數據源。

圖1　80個樣本的主成分分析結果(PC1 vs PC2)

2結果與討論

2.1主成分分析

在過往的一些食品真假鑒別中只是簡單比較樣品間的某種儀器響應值，但對于LC-TOF/MS采集得到的多維海量數據，傳統的簡單比較法無法獲得樣本間的差異特征，不能有效識別樣本。PCA是一種線性降維方法，是對多變量數據進行統計處理的一種最古老的多元統計分析方法，在分析化學中多用于對數據進行降維、壓縮、變量的選擇以及去相關[17]。在PCA數據處理中一般是觀察貢獻最大的3個主成分(PC1，PC2，PC3)，選取主成分兩兩之間作二維投影圖，如PC1vsPC2(圖1a和1b)，可實現海量數據的降維，從而直觀地顯示樣本間的關系。

圖2　80個樣本的PC1分值(Square/Pareto)Fig.2　PC1 scores of 80 samples(Square/Pareto)

在對20種乳粉共計80份樣品的LC-TOF/MS數據進行PCA處理時，發現無論選擇何種量綱(如No scaling，Mean Center，Autoscale，Pareto，Range Scale)或加權因子(如對數、開平方)，20種乳粉均分成非常明顯的二大樣品組，一組是3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉，另一組是剩余17種未添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉及普通乳粉。圖2為20種樣本的PC1分值圖，顯示了3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉(B，G，Q樣本)的PC1分值明顯高于其它17種樣品，表明應用PCA數據處理技術可以有效識別添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉。

此外，從圖1c和d可觀察到，不同品牌的3種添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉之間存在一定的區別，當改變量綱或加權因子時，添加水解蛋白的3組樣品會發生組內平行樣的聚合度或組間離散度的輕微改變。

2.2主成分-判別分析

對20組樣品的數據進行分組標識，隨后進行主成分-判別分析(PCA-DA)，分析結果顯示樣品組內差異減少，組間差異顯著增大，在PCA中B和G兩組樣品分離不明顯，但通過PCA-DA處理后均實現了顯著的分離(見圖1c和d)。這是因為PCA-DA是一種有監督模式的主成分分析，在數據分析時考慮了樣品分組信息，并對可有效表達樣品組特征的質譜峰進行加權處理，從而顯著改善和增強樣品組間的分離。

2.3T檢驗

由于參與數據分析的樣品組數量較大，與PCA方法相比采用T檢驗更適合提取樣品的特征組分，分別將添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉對其它樣品組進行T檢驗分析(如B#vsothers)。

在T檢驗中，通常以P≤0.05,log(fold change)的絕對值=2作為條件來選擇特征數據點，log(fold change)為正值的組分可視為表征目標樣品的特征組分，log(fold change)為負值的組分則可視作是表征其它19種非目標樣品的特征組分。由于參與分析的樣品組數量較大，即使log(fold change)=2，篩選出的組分仍缺乏特征性，即非目標樣品組也含有目標樣品組的特征組分，因此需設置更為嚴格的T值檢驗參數方能提取出具有唯一性的目標樣品特征組分。數據處理結果表明，只有將log(fold change)值設置為∞，方可篩選出目標樣品含有的具唯一性的特征組分。最終確定先以P≤0.05條件提取數據，再從初步提取出的數據中以log(fold change)=∞為條件進一步提取出目標樣品的特征組分。結果發現最終的化學特征組分數據的P值均小于10-10，表明對于來源復雜的嬰幼兒配方乳粉，在進行樣品差異性表達分析時不能單純依從一般性的數據提取條件，而應采用更為“苛刻”的數據提取條件方能獲得理想的數據分析結果。表1描述了1個標稱添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉(G樣品)的化學指紋圖信息。

對20種樣品進行LC-MS/MS多反應監測(MRM)模式掃描，可以觀察到表1所列G樣品的16個化學特征組分均只出現在G樣品的MRM圖中(見圖3,圖中組分編號與表1相同)，而其它樣品中均未檢出，表明這16個化學特征組分可充分表征G樣品并構成其化學指紋圖。

圖3　G號樣品中16個組分的MRM提取離子流圖

No.Quasi-moleculeionforexperimentalvaluem/ztR/minChargePossibleformulaQuasi-moleculeionfortheoreticalvaluem/zMasserrorppmQualitativeionpairm/z1322.14341.51C12H23N3O5S322.14310.9322.1/223.12235.14285.11C8H18N4O4235.140111.5235.1/136.13484.75445.12C54H73N5O7S2484.7548-0.8484.8/361.74343.19745.53C42H78N18O8S2343.19701.2343.2/244.25498.74825.82C46H77N9O7S4498.7487-1.0498.7/390.76654.66506.03C84H140N18O35654.66490.2654.7/583.37263.13896.41C14H18N2O3263.1390-0.4263.1/136.18772.36156.51C32H41N19O5772.36110.5772.4/545.29433.75316.62C41H71N9O7S2433.7532-0.2433.8/116.110439.72986.82C35H59N17O8S439.7299-0.2439.7/217.111965.56587.01C41H88N8O9S4965.56302.9965.6/751.412380.73927.22C30H61N15O6S380.7398-1.6380.7/322.213981.50057.41C43H80N8O9S4981.50040.1981.5/360.214400.20157.62C32H50N18O5S400.2039-6.0400.2/120.115765.32958.31C34H48N6O14765.3301-0.8765.3/321.216770.48098.41C39H67N3O12770.47981.4770.5/360.2

3結論

本研究結果表明，采用液相色譜-高分辨質譜檢測技術并結合化學計量學統計分析，可實現添加水解蛋白的嬰幼兒配方乳粉化學指紋圖的構建和有效表征，為嬰幼兒配方乳粉的安全檢測帶來了新的技術思路。

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Research on the Chemical Fingerprinting of Infant Formula Powder Based on Liquid Chromatography-Quadrupole/Time-of-Flight Mass Spectrometry and Chemometrics

LIN Feng1,2*,WU Ying-xuan1,2,OUYANG Shao-lun1,2,SHAO Lin-zhi1,2，ZOU You1,2,DU Zhi-feng3

(1.Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou510623,China;2.Key Laboratory of Animals and Plants and Food Import and Export of Technical Measures in Guangdong Province,Guangzhou510623,China;3.AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center,Shanghai200233,China)

Abstract：18 infant formula powder samples were analyzed by RP LC-Q-TOF MS,and potential chemical markers were filtered by PCA.Different parameters for pretreatment on the results of data analysis were studied.The characteristic components of partially hydrolyzed protein in infant formula powder were found by T-test.The chemical information of 16 characteristic components in G sample was proposed,and the correspongding chemical fingerprinting was constructed.

Key words：chemical fingerprinting；chemometrics；liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry(LC-Q/TOF-MS);infant formula powder

收稿日期：2015-08-18；修回日期：2015-09-20

基金項目：國家質檢總局項目(2012IK150)；廣東省科技計劃項目(2014A040401064)

*通訊作者：林峰，研究員，研究方向：食品中痕量有機污染物分析，Tel：020-38290337，E-mail：linf@gdciq.gov.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.020

中圖分類號：O657.63;TS252.51

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0487-05