固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水果中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量

仲伶俐，胡　莉，郭靈安，雷紹榮，毛建霏，李　曦，歐陽華學(xué)

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川　成都　610066)

固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水果中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量

仲伶俐，胡莉，郭靈安*，雷紹榮，毛建霏，李曦，歐陽華學(xué)

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都610066)

摘要：建立了固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定水果中6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的分析方法。水果樣品經(jīng)乙腈提取，NH2固相萃取小柱進(jìn)行富集、凈化，以二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫溶液，濃縮定容后，用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱分離，流速0.3 mL/min，以水-甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，于UPLC-MS/MS儀多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 1～0.999 6。在0.004，0.02，0.1 mg/kg加標(biāo)水平下，方法的回收率為75.6%～110.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%～12.8%，方法檢出限(LOD,S/N≥3)為0.001～0.002 mg/kg，定量下限(LOQ,S/N≥10)為0.003～0.006 mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，適用于水果中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞：固相萃取;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;水果;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulator，PGR) 又稱外源植物激素，是人工合成的與內(nèi)源激素有相似生理作用的生長(zhǎng)物質(zhì)。6-芐基腺嘌呤(6-BA)、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑均為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)果樹休眠、生根、生長(zhǎng)、花芽分化、著果、果實(shí)發(fā)育、成熟期、果實(shí)品質(zhì)及抗逆性方面有調(diào)節(jié)作用，已被廣泛應(yīng)用于果樹生長(zhǎng)過程[1-4]。日本對(duì)水果中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留限量的規(guī)定最為詳細(xì)，其對(duì)多種水果中6-芐基腺嘌呤、氯吡脲和多效唑均有限量要求，分別為0.02～0.1 mg/kg,0.01～0.1 mg/kg和0.01～1 mg/kg;烯效唑在草莓和鱷梨中的最大殘留限量為0.1，0.5 mg/kg[2,5]。而我國(guó)規(guī)定噻苯隆在葡萄和甜瓜中的最大殘留限量為0.05 mg/kg;氯吡脲在橙、枇杷、獼猴桃、葡萄中的最大殘留限量為0.05 mg/kg;多效唑在蘋果、荔枝中的最大殘留限量為0.5 mg/kg;6-芐基腺嘌呤和烯效唑尚無限量要求[6]。

目前植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留的測(cè)定方法有衍生化氣相色譜法[7]、高效液相色譜法[8-10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-16]。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的化學(xué)性質(zhì)差異較大，殘留量低，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀以其高選擇性和高靈敏度在多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留同時(shí)測(cè)定中頗具優(yōu)勢(shì)[17]，樣品前處理通常采用QuEChERS法[11-12]或固相萃取(SPE)法[13-16]，雖然QuEChERS法簡(jiǎn)單、快速，但SPE法在除雜質(zhì)能力和穩(wěn)定性上更加優(yōu)越。本文采用氨基固相萃取小柱凈化樣品，UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水果中6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑殘留量，前處理凈化時(shí)只使用1種淋洗液，相比于文獻(xiàn)中使用多種淋洗液或洗脫液的SPE法，更加簡(jiǎn)便、快捷，操作時(shí)間短，凈化效果好，準(zhǔn)確度和靈敏度能夠滿足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);IKA T18高速勻質(zhì)機(jī)(德國(guó)IKA公司)，R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)Buchi公司)，LD5-2A高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)，WH-3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)，DT-1002A電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)，0.22 μm微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品：6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑、烯效唑(純度≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司);甲醇、乙腈、二氯甲烷(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司);氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司);NH2固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國(guó)Thermo公司);Florisil固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國(guó)Agilent公司);實(shí)驗(yàn)用水均由優(yōu)普超純水系統(tǒng)制備。

1.2試樣制備

取不少于1 000 g樣品，取可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面的附著物，將樣品縮分至250 g，粉碎后密封，制成試樣備用，剩余試樣于-18 ℃保存。

1.3樣品前處理

稱取10 g粉碎好的試樣于100 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈，高速勻漿2 min，加入10 g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1 min，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min，使乙腈和水相分層。移取10.0 mL上層乙腈溶液至100 mL梨形瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入4 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)淋洗液溶解殘?jiān)⒃摌悠啡芤阂迫胗昧芟匆夯罨玫腘H2固相萃取小柱中，收集流出液于50 mL雞心瓶中，用3.0 mL淋洗液洗滌梨形瓶2次，移入NH2固相萃取小柱，合并洗脫液，在30 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用2.0 mL甲醇-水(1∶1)溶解殘?jiān)?jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜測(cè)定。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);流速：0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相：A為水，B為甲醇;洗脫程序：0～1.0 min，60% A;1.0～3.0 min，60%～30% A;3.0～4.0 min，30%～10% A;4.0～4.2 min，10%～60% A;4.2～5.2 min，60%A。

電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，毛細(xì)管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣(N2)溫度：350 ℃，脫溶劑氣流速：700 L/h，錐孔氣流速：50 L/h，碰撞氣(Ar)流速：2.5 L/h。5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的定性、 定量離子對(duì)等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1　5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

*quantitative ion

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在C18色譜柱上均有很好的保留，實(shí)驗(yàn)選擇1.7 μm C18色譜柱，采用梯度洗脫，提高了單位樣品的分析效率并減少了強(qiáng)保留雜質(zhì)在色譜柱的累積。考察了水-甲醇、0.1%甲酸-甲醇、1 mmol/L醋酸銨-甲醇、0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨4種流動(dòng)相的分離效果，最終確定以水-甲醇為流動(dòng)相，在“1.4”梯度洗脫條件下，5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均能獲得較好的色譜峰形和穩(wěn)定的信號(hào)強(qiáng)度。

2.2質(zhì)譜條件的確定

5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均易離子化，適合采用ESI源。實(shí)驗(yàn)首先采用直接進(jìn)樣方式，分別在ESI+/ESI-模式下找到母離子，然后通過調(diào)節(jié)碰撞能量選擇2個(gè)相對(duì)豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子，分析時(shí)再結(jié)合化合物的保留時(shí)間等信息，進(jìn)行定性、定量分析。5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的離子對(duì)及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3凈化方法的選擇

水果樣品經(jīng)乙腈提取，鹽析分層，目標(biāo)物連同雜質(zhì)被萃取至乙腈溶液中。本研究通過對(duì)Florisil和NH2凈化柱，以及丙酮-正己烷、乙酸乙酯-乙醇、二氯甲烷-甲醇3種洗脫溶劑采用正交試驗(yàn)進(jìn)行回收率效果測(cè)試，最終確定以NH2小柱凈化，10 mL二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫液。此凈化條件下，5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的特征離子在水果樣品中具有很好的特異性，草莓加標(biāo)樣品的MRM圖譜見圖1。

2.4線性范圍、檢出限與定量下限

配制5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度分別為5，10，50，100，500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度(x，ng/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種待測(cè)物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果顯示，5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.996 1～0.999 6。通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10的峰響應(yīng)值與樣品前處理的稀釋倍數(shù)，得出各化合物的方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的方法LOD為0.001～0.002 mg/kg，LOQ為0.003～0.006 mg/kg，均滿足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

圖1　草莓加標(biāo)樣品中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MRM圖譜(0.004 mg/kg)

CompoundRegressionequationr2LOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)6-BAy=898.59x+822.060.99920.0010.003Thidiazurony=505.46x+1826.250.99960.0020.006Forchlorfenurony=644.44x+455.960.99860.0010.003Paclobutrazoly=27.10x-22.050.99950.0020.006Uniconazoley=204.70x+3959.230.99610.0010.003

2.5方法的準(zhǔn)確度與精密度

選擇蘋果、葡萄、李子、芒果、獼猴桃、草莓6種水果樣品進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度為0.004，0.02，0.1 mg/kg，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。結(jié)果顯示，6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑在水果樣品中的平均回收率為75.6%～110.5%，RSD為1.2%～12.8%，本方法下5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有良好的準(zhǔn)確度與精密度，符合多農(nóng)殘分析要求。

表3　5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在水果中的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

2.6實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)30個(gè)草莓樣品進(jìn)行測(cè)定，其中噻苯隆未檢出，6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和烯效唑均有檢出，其殘留量分別為0.001～0.048 mg/kg，0.011～0.043 mg/kg，0.006～0.064 mg/kg和0.008 1～0.023 mg/kg。

3結(jié)論

本文建立了氨基固相萃取小柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定水果中6-芐基腺嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、多效唑和烯效唑殘留量的方法。5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢出限為0.001～0.002 mg/kg，定量下限為0.003～0.006 mg/kg，在0.004，0.02，0.1 mg/kg加標(biāo)水平下，回收率為75.6%～110.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～12.8%。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，能夠滿足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)要求，可用于單個(gè)或同時(shí)分析水果中5種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量。

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Determination of 5 Plant Growth Regulator Residues in Fruits by Solid Phase Extraction and Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHONG Ling-li，HU Li，GUO Ling-an*，LEI Shao-rong，MAO Jian-fei，LI Xi，OUYANG Hua-xue

(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu610066，China)

Abstract：A method for the simultaneous determination of 5 plant growth regulator residues,including 6-benzyl adenine(6-BA)，thidiazuron，forchlorfenuron，paclobutrazol and uniconazole in fruits was developed by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) with solid phase extraction(SPE).Samples were extracted with acetonitrile，then the extracts were concentrated and cleaned up on a NH2 solid phase extraction cartridge with dichloromethane-methanol(92∶8) as elution solution.Sample preparation was accomplished after concentrated and redissoved.The UPLC-MS/MS method was performed with Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) column using water-methanol as mobile phase by gradient elution，at a flow rate of 0.3 mL/min.The target compounds were determined by UPLC-MS/MS under multi reaction monitoring(MRM) mode，and then quantitatively analyzed by external standard method using the matrix-matched standard solution.The results showed that there were good linearities for 5 plant growth regulators between peak areas and concentrations in the range of 5-500 ng/mL under the optimal conditions，with correlation coefficients(r2) of 0.996 1-0.999 6.The spiked recoveries of 5 plant growth regulators in fruits at three spiked levels of 0.004，0.02，0.1 mg/kg ranged from 75.6% to 110.5% with relative standard deviations(RSDs) of 1.2%-12.8%.The limits of detection of this method(LOD) were in the range of 0.001-0.002 mg/kg，and the limits of quantitation(LOQ) were 0.003-0.006 mg/kg.The established method was simple，sensitive，accurate and reliable，and could meet the requirements of multi pesticide residues analysis in fruits.

Key words：solid phase extraction(SPE);ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);fruits;plant growth regulators

收稿日期：2015-08-27;修回日期：2015-09-23

基金項(xiàng)目：四川省財(cái)政基因工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012QNJJ-026);四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興學(xué)科(2013XXXK-023)

*通訊作者：郭靈安，副研究員，研究方向：食品質(zhì)量與安全，Tel:028-84504149，E-mail：gla028@163.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.016

中圖分類號(hào)：O657.63;TQ314.254

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1004-4957(2016)04-0466-05