基于雙光子誘導(dǎo)熒光的腫瘤標(biāo)志物CA125的實時動態(tài)可視化活檢

黃池寶，曾伯平，陳華仕，陳曉遠(yuǎn)

(1.遵義師范學(xué)院　化學(xué)化工學(xué)院，貴州　遵義　563002;2.韶關(guān)學(xué)院　農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東　韶關(guān)　512005)

基于雙光子誘導(dǎo)熒光的腫瘤標(biāo)志物CA125的實時動態(tài)可視化活檢

黃池寶1，2*，曾伯平1，陳華仕1，陳曉遠(yuǎn)2

(1.遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州遵義563002;2.韶關(guān)學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005)

摘要：糖鏈抗原CA125(Ag)是腫瘤早期及癌變期最重要的標(biāo)識物，該文利用抗CA125單克隆抗體Ab125(Ab)特異性親合抗原的原理，用制備的雙光子熒光標(biāo)記探針LP標(biāo)記抗體(LP-Ab)以特異性識別CA125，用近紅外激光激發(fā)抗原-抗體復(fù)合物(LP-Ab·Ag)，利用復(fù)合物熒光實現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物CA125的量化檢測和實時動態(tài)成像。該方法簡單易行，克服了單光子熒光檢測中的光致毒與光漂白，且能顯著提高成像的分辨率、清晰度與靈敏度，對腫瘤及癌變的早期診斷與預(yù)防具有重要意義。

關(guān)鍵詞：糖鏈抗原CA125;Ab125;免疫熒光標(biāo)記;雙光子;活檢

糖鏈抗原CA125(Carbohydrate antigen 125)是一種與卵巢癌、輸卵管腺癌、子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)識物[1-4]。抗CA125單克隆抗體為OC125[5]，簡稱Ab125。對于CA125的檢測方法報道較多[6-8]，但這些方法不具備專一性，靈敏度及穩(wěn)定性差，且操作繁瑣費時，檢測試樣限于血液與外周血。因此，快速、專一、可靠地檢測體內(nèi)CA125方法的研究，對于早期腫瘤與癌癥的診治及預(yù)警具有十分重要的理論和現(xiàn)實意義。

直接免疫熒光法特異性強、靈敏度高、速度快、無放射性污染(與放射免疫法相比)、操作簡便、便于推廣[9]。單光子熒光激發(fā)波長一般在350～560 nm，易產(chǎn)生光致毒與光漂白[10-11];而雙光子熒光采用800～1 100 nm 的高強度激光作為激發(fā)光源，不僅能克服單光子熒光的缺點，還能實現(xiàn)深層暗場成像與定點激發(fā)，避免組織自發(fā)熒光干擾以及降低組織吸光系數(shù)，從而顯著提高成像的清晰度、檢測靈敏度與分辨率[12-14]。

該文以報道的雙光子熒光探針LP[15]標(biāo)記抗糖鏈抗原抗體Ab125，借助抗原-抗體特異性識別原理與雙光子誘導(dǎo)熒光機制研究了腫瘤標(biāo)志物糖鏈抗原CA125的實時動態(tài)活檢。目前利用免疫雙光子熒光法對CA125的可視化實時動態(tài)活檢尚無文獻(xiàn)報道。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

2-(4-乙烯基苯基)苯并噻唑(7)根據(jù)文獻(xiàn)[16]合成，Ab125(上海江萊生物科技有限公司)，PBS(1.35 mol/L NaCl，47 mmol/L KCl，100 mmol/L Na2HPO4，20 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4，上海博谷生物科技有限公司)，1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(化學(xué)純，揚州市普林斯化工有限公司)，碳酸丙烯酯(化學(xué)純，臨沂市利興化工有限公司)，醋酸鈀(化學(xué)純，上海盈公生物科技有限公司)，三(鄰-甲基苯基)磷(化學(xué)純，鄭州阿爾法化工有限公司)，Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚，化學(xué)純，廣州市應(yīng)泓化工有限公司)，DMEM(達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司)，F(xiàn)BS(胎牛血清，江蘇雨桐生物科技有限公司)，DCC(二環(huán)己基碳二亞胺，山東巨業(yè)精細(xì)化工有限公司)，膠原酶Ⅰ(北京索萊寶科技有限公司)，乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、N，N'-雙(2-乙磺酸)哌嗪(PIPES)、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磷酸(HEPES)購于南京安培化工科技有限公司，其它所用試劑和溶劑均為分析純，各試劑使用前均經(jīng)除水精制。

VARIAN INOVA 400 MHz 核磁共振儀(美國 Varian公司);HP 8453紫外、可見分光光度儀(美國惠普公司);RF-5000熒光分光光度儀(日本島津公司);分光光度計(Spectra-max190.Molecular Devices，USA);EIMS譜用GC-TOFMS(EI源)(美國Waters公司);XT-4雙目顯微熔點測定儀;HP1100LC / ESI-MSD型電噴霧質(zhì)譜儀(美國Agilent Technologies公司);FT / IR-430紅外光譜儀(波數(shù)掃描范圍為350～7 800 cm-1，KBr壓片法，日本Jasco公司);Perkin2400(Ⅱ)元素分析儀(美國 Perkin公司);Mira 900-F鎖模飛秒鈦藍(lán)寶石激光器(美國Coherent公司)。

1.2標(biāo)記探針LP的合成

雙光子熒光標(biāo)記探針LP根據(jù)文獻(xiàn)[15]合成(見圖1)。LP為黃色固體物質(zhì)(m.p.217～218 ℃)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.134(dd，6H，Ph-H)，7.933(d，2H，Ph-H)，7.721(t，6H，4H，CH=CH，and 4H，Ph-H)，7.615(s，2H，Ph-H)，7.584(d，2H，Ph-H)，7.521(t，2H，Ph-H)，7.413(t，2H，Ph-H)，7.335(m，4H，Ph-H)，3.232(m，7H，OCH2，CH3)，2.884(t，2H，OCH2)，2.765(s，4H，CH2)，2.581(m，4H，CH2)，1.953(m，2H，CH2)。13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：170.545(C=O)，167.416(Ar-C=N)，157.103，154.175，149.362，140.854，140.513，137.075，135.014，132.236，131.352，128.264，127.853，127.317，123.425，122.971，121.773，71.852，69.921，58.764，55.735，52.606，48.344，34.236，26.224，25.382。元素分析(%，C55H45N3O6S2計算值)：C 72.71(72.74)，H 5.06(4.99)，N 4.68(4.63)，O 10.53(10.57)，S 7.01(7.06);HRMS(EI)(C55H45N3O6S2計算值)，m/z：907.275 3(907.275 0)。結(jié)果與文獻(xiàn)報道基本一致。

1.3探針LP標(biāo)記抗糖鏈抗原抗體

抗體Ab(Ab125)(2 mg，約1.0×10-5mmol)溶于0.5 mL二甲亞砜(DMSO)，用NaHCO3(0.1 mol/L)溶液將pH值調(diào)至9.0，將LP(10 μg，1.1×10-5mmol)加入反應(yīng)混合液中，攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加入4倍反應(yīng)液體積的乙醚稀釋反應(yīng)混合物，析出沉淀，過濾得固體，再加入DMSO直至剛好溶解，于溶解液中加入乙醚直至不再析出沉淀，過濾、干燥，得黃色固體(約1.8 mg)，即為LP-Ab。SDS-凝膠電泳法測定其分子量約為 156 kD。

圖1　LP的分子結(jié)構(gòu)與合成步驟Fig.1　The molecular structure and synthetic procedures of LP

1.4腫瘤單細(xì)胞懸液制備

圖2　LP-Ab的吸收與單光子發(fā)射光譜Fig.2　Absorption and one-photon emission spectra of LP-AbPHEMO buffer with 0.05% Triton X-100(pH 7.2);c(LP-Ab)(Abs)=10 μmol/L，c(LP-Ab)(Em)=1 μmol/L

將10% FBS、青霉素(100 units/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)補加到細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM中并混合均勻，于此溶液中培養(yǎng)小鼠卵巢腫瘤細(xì)胞。先將新鮮小鼠卵巢腫瘤組織剪碎成大小1 mm3的碎塊，然后加入0.1%膠原酶Ⅰ型消化，每30 min消化1次，取消化的懸浮細(xì)胞，用含血清的培養(yǎng)液中和胰酶，離心并用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于4 ℃下保存，待消化完全后，將消化后的細(xì)胞懸液通過160～200目的篩網(wǎng)，即得單細(xì)胞懸液。然后，接種到培養(yǎng)瓶中，貼壁1.5 h后，除去貼壁細(xì)胞(主要是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)，得到較純的備用腫瘤細(xì)胞。成像前兩天進(jìn)行細(xì)胞篩選處理。小鼠胰腺腫瘤細(xì)胞采用同樣方式制備。

成像操作前，先除去培養(yǎng)介質(zhì)，再換上含0.05% Triton X-100的PHEMO 緩沖液(68 mmol/L PIPES，25 mmol/L HEPES，15 mmol/L EGTA，3 mmol/L MgCl2，10% DMSO)。

2結(jié)果與討論

2.1標(biāo)記抗體LP-Ab的吸收與熒光光譜

標(biāo)記抗體LP-Ab(Abs：10 μmol/L;Em：1 μmol/L)在含0.05% Triton X-100的PHEMO 緩沖液中的吸收(Abs)與發(fā)射(Em)光譜見圖2。由圖可知，最大吸收與發(fā)射波長分別為413，485 nm，斯托克斯位移(Stokes shift)為72 nm，吸收光譜與發(fā)射光譜在400～475 nm間有部分重疊，但分隔較清楚，對熒光測試干擾較小。采用雙光子激發(fā)可以更大程度地消除這種激發(fā)光對發(fā)射光的影響。經(jīng)測定，LP-Ab125的熒光量子產(chǎn)率為0.70，有較強的熒光，可以提高檢測的靈敏度與成像的清晰度。

2.2標(biāo)記抗體LP-Ab的雙光子激發(fā)譜及雙光子吸收截面

雙光子激發(fā)熒光光譜的激發(fā)源是一臺鎖模飛秒鈦藍(lán)寶石激光器(Coherent，Mira 900-F)，激光脈沖寬度120 fs，重復(fù)頻率76 MHz，激光器的平均輸出功率1.5 W(800 nm)，可調(diào)波長范圍700～980 nm，在實驗中飛秒激光波長調(diào)至所需測試波長。熒光檢測利用徠卡共聚焦顯微鏡熒光檢測系統(tǒng)檢測。

以熒光素水溶液(pH 11.0)的雙光子激發(fā)熒光發(fā)射[20]作參比，室溫下在同一波長下分別測定樣品與參比(溶液為空氣所飽和)的雙光子激發(fā)熒光信號，溶液濃度為10-6～ 10-5mol/L測定樣品的δ。

圖3　LP和 LP-Ab的雙光子發(fā)射光譜Fig.3　Two-photon action spectra of LP and LP-AbPHEMO buffer with 0.05% Triton X-100(pH 7.2)；c(LP-Ab)=10 μmol/L

測定了標(biāo)記抗體LP-Ab(10 μmol/L)在含0.05%Triton X-100的PHEMO 緩沖液中的雙光子發(fā)射譜(圖3)。由圖可知，當(dāng)雙光子激發(fā)波長為740 nm時,LP-Ab125的雙光子吸收截面最大(980 GM)，隨雙光子激發(fā)波長的增大，LP-Ab125的雙光子吸收截面逐漸降低，且最初降低速度較快，此后降低速度顯著減小。因此本實驗選用740 nm作為最佳雙光子激發(fā)波長。

2.3腫瘤活細(xì)胞實時動態(tài)活檢

細(xì)胞用1 μmol/L LP-Ab在組織培養(yǎng)室中(5%CO2，37 ℃)孵化30 min，然后用PBS洗3次，并于無色血清游離介質(zhì)中再孵化15 min后成像操作。用標(biāo)記抗體LP-Ab研究腫瘤細(xì)胞的雙光子共聚焦熒光顯微照片(見圖4)，激發(fā)波長為740 nm，收集450～500 nm通道的熒光。

3結(jié)論

借助雙光子熒光染料標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物，利用免疫反應(yīng)原理，實現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物動態(tài)全息深度成像，不但能準(zhǔn)確診斷早期腫瘤發(fā)生與否，而且能夠在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中對某些關(guān)鍵單分子事件和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程實施動態(tài)監(jiān)測，為揭示癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制提供了銳利工具。

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Real Time Dynamic Visualization Biopsy of Tumor Marker CA125 Based on Two-photon Induced Fluorescence

HUANG Chi-bao1，2*，ZENG Bo-ping1，CHEN Hua-shi1，CHEN Xiao-yuan2

(1.Chemistry and Chemical Engineering College，Zunyi Normal University，Zunyi563002，China;2.College of Agricultural Science and Engineering，Shaoguan University,Shaoguan512005，China)

Abstract：Carbohydrate antigens CA125(Ag) are the most important markers in early stage of tumor and cancer stage.Antibodies Ab125(Ab) to carbohydrate antigens were labeled to form probe-labeled antibodies LP-Ab using the prepared two-photon fluorescence probe LP.On the basis of the antigen-antibody specificity affinity principle，LP-Ab could combine with carbohydrate antigen into a complex LP-Ab·Ag which emitted strong two-photon fluorescence to accomplish the high sensitive biopsy and the real-time dynamic high-resolution imaging of the tumor markers.The easy，simple and quick method could not only overcome photodamage，photobleaching and tissue auto-fluorescence disturbance，but also be used to observe and study the dynamic transfer mechanisms of the tumor markers in cells and the mechanism of carcinogenesis.The research in this project is very useful in the early diagnosis and prevention of tumor and canceration.

Key words：CA125;Ab125;immunofluorescence labeling;two-photon;biopsy

收稿日期：2015-09-29;修回日期：2015-10-14

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21562050);貴州省第八批科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊建設(shè)專項基金(黔科合人才團(tuán)隊(2015)4007號);貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(黔科合J字[2015]2146號);貴州省教育廳自然科學(xué)重點研究項目(黔教合KY字[2014]296);貴州省教育廳省級本科教學(xué)工程建設(shè)項目(黔教[2014]JXGChcb);遵義市“15851人才精英工程”項目((2015)4007)；遵義市紅花崗區(qū)科學(xué)技術(shù)項目(遵紅科合社字[2015]18)

*通訊作者：黃池寶，博士，教授，研究方向：雙光子熒光探針及其顯微成像，Tel：0851-28927159，E-mail：huangchibao@163.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.021

中圖分類號：O657.3;S852.43

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0492-05