調節性T細胞對LPS誘導的小鼠早產模型胎盤炎癥反應的影響

王　凡, 林曉潔, 肖　謐, 陳茹娟, Muhammad Siddiq, 劉　俐

(西安交通大學醫學院第一附屬醫院 新生兒科, 陜西 西安, 710061)

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調節性T細胞對LPS誘導的小鼠早產模型胎盤炎癥反應的影響

王凡, 林曉潔, 肖謐, 陳茹娟, Muhammad Siddiq, 劉俐

(西安交通大學醫學院第一附屬醫院 新生兒科, 陜西 西安, 710061)

摘要:目的研究調節性T細胞對脂多糖(LPS)誘導的小鼠早產模型胎盤炎癥反應的影響。方法孕17 d小鼠分組為腹腔注射PBS組(Control組)，腹腔注射LPS(LPS組)，腹腔注射LPS并尾靜脈注射PBS組(LPS+PBS組)，腹腔注射LPS并尾靜脈注射Treg組(LPS+Treg組)。構建LPS腹腔注射誘導的17 d孕小鼠早產模型。在第2劑LPS注射后1、6、12 h及出生時留取胎盤組織，檢測Treg細胞標志物叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)、白血病抑制因子(LIF)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和白介素 6(IL-6) mRNA及蛋白表達水平。結果① LPS組早產率100%，Control組未發生早產，LPS+Treg組早產率與LPS組和LPS+PBS組差異無統計學意義(P>0.05)。② LPS組與LPS+PBS組胎盤組織中Foxp3、HO-1、LIF在第二劑LPS注射后1、6、12 h及出生時表達顯著下降，IL-6表達顯著增高；LPS+Treg組Foxp3、HO-1、LIF表達明顯增高，IL-6表達顯著降低。結論在LPS腹腔注射誘導的早產小鼠模型中，胎盤組織Treg減少可能是早產的機制之一，HO-1、LIF參與了Treg在母胎界面維持的獨特的免疫微環境；Treg過繼治療可通過降低IL-6的表達減輕胎盤組織炎癥反應。

關鍵詞:叉頭翼狀螺旋轉錄因子; 脂多糖; 早產; 胎盤; 小鼠模型

感染是早產的主要原因，它可以激活孕母及胎兒的炎癥反應[1]。胎兒作為一種半同種異體移植物植入母體并不被母體免疫系統排斥，其中妊娠的免疫耐受機制起重要作用。調節性T細胞(Treg)在母胎界面介導一個特殊的免疫微環境，使母體的免疫系統對胎兒產生免疫耐受，維持胎兒正常生長，母胎界面Treg細胞減少是早產的機制之一[2-3]。Treg細胞發育及功能失調，與多種重大免疫相關性疾病有關[4]，其中叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)為CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志，在Treg細胞發育和功能維持中起著重要作用[5-6]。孕母Treg細胞不僅被證明與流產和早產密切相關，而且動物實驗已經證明在胚胎著床期，即孕0～4 d，孕鼠注射Treg細胞可以完全阻止早產的發生[7]。雖然Treg細胞在自發性早產發生中的角色已被證實，但Treg細胞在孕晚期宮內感染誘導早產中的作用機制仍不明確，對其作用機制的研究將為預防或治療宮內感染相關早產提供新的靶點。本研究擬以脂多糖(LPS)腹腔注射17 d孕鼠為研究對象，構建宮內感染誘導早產模型，并選孕14 d小鼠脾臟Treg細胞，尾靜脈注射，探討宮內感染17 d孕鼠胎盤組織Treg細胞以其相關因子在Treg細胞治療前后的變化。

1材料與方法

1.1研究對象及分組

1.1.1模型構建: ① 小鼠來源：清潔級Balb/C雌鼠，體質量20～25 g，C57雄鼠，體質量25～30 g，8～10周，購自西安交通大學醫學院動物實驗中心，每日日照12 h。以雌∶雄=2∶1合籠飼養，每日晨8：00檢查雌鼠陰道情況，如見到明顯陰道栓，則可確認受孕，見栓當日計為孕0 d。② 動物分組：每15只孕鼠隨機分為一組，共4組，即腹腔注射PBS組(Control組)，腹腔注射LPS(LPS組)，腹腔注射LPS+尾靜脈注射PBS組(LPS+PBS組)，腹腔注射LPS+尾靜脈注射Treg組(LPS+Treg組)。在注射第2劑LPS后1、6、12 h及出生時留取胎盤組織。前3個時間點各3只孕鼠，出生時各6只孕鼠。③ LPS誘導宮內感染早產模型的構建：雌鼠孕齡17 d時，分別于下午2時和5時腹腔注射LPS(LPS，E．coli，serotype 055：B5；Sigma)，劑量50 μg/kg。

1.1.2Treg細胞磁珠分選：從14 d相同種系正常孕鼠脾臟提取單細胞懸液，利用CD4+CD25+Foxp3 Treg磁珠分選試劑盒(購自德國美天旎公司)進行Treg 細胞的分選，取分選后的Treg細胞用CD4-FITC(購自德國美天旎公司)進行標記，流式細胞儀檢測分選后的Treg細胞濃度大于90%。以2×105/200 μL PBS個Treg 細胞對小鼠尾靜脈注射。

1.2方法

1.2.1小鼠實驗標本的釆集：孕鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，打開腹腔，分離每個胎盤，將分離的完整胎盤組織放入預先盛有預冷無菌生理鹽水的培養皿清洗3遍，標記后迅速放入液氮，2 d后轉入-80 ℃低溫冰箱，Western blot和RT-PCR備用。

1.2.2RT-PCR檢測胎盤組織Foxp3、血紅素加氧酶(HO-1)、白血病抑制因子(LIF)、IL-6 mRNA的表達情況：胎盤從-80 ℃冰箱中取出，稱重25～30 mg組織，放入無菌無酶的一次性勻漿器中勻漿。按照Tissue RNA Prep kit(OMEGA 美國)和PrimeScriptTMRT MasterMix(TaKaRa 日本)操作說明抽提和逆轉錄RNA。紫外分光光度儀檢測抽提總RNA的濃度和純度，本實驗所測RNA樣品A260/A280比值為1.8～2.0，濃度350～500 ng/μL。Bio-Rad CFX Manager 進行RT-PCR，SYBR R Premix Ex TaqTM(TaKaRa日本)為檢測標志，反應體系為 10 μL。反應條件：第一步：95 ℃，30 s; 第二步：40個循環，95℃，15 s，60 ℃，30 s。引物序列TaKaRa生物公司合成序列如下: Foxp3: 正義5′-AGGGCCAGCATAGGTGCAAG-3′, 反義5′-AGTGCCTGTGTCCTCAATGGTC-3′; HO-1: 正義 5′-CTGGAGATGACACCTGAGGTCAA-3′, 反義5′-CTGACGAAGTGACGCCATCTG-3′; LIF: 正義5′-AAGAATCAACTGGCACAGCTCAA-3′, 反義5′- AGGTATGCGACCATCCGATACA-3′; IL-6: 正義5′-CAACGATGATGCACTTGCAGA-3′, 反義5′-CTCCAGGTAGCTATGGTACTCCAGA-3′; 轉化生長因子(TGF-β)1: 正義5′-TACGGCAGTGGCTGAACCAA-3′, 反義5′-CGGTTCATGTCATGGATGGTG-3′。

1.2.3Western-Blot技術檢測各組中小鼠胎盤組織中FOXP3、HO-1、LIF以及干擾素-6(IL-6)蛋白的表達水平：按照RIPA(西安赫特生物科技有限公司)和Bradford protein assay reagent(Bio-Rad)操作說明抽提總蛋白并進行蛋白質定量。根據蛋白定量上樣，變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并將蛋白質轉移到PVDF膜，膜在10%脫脂奶粉溶液中室溫孵育3～4 h以封閉膜上的非特異結合。用兔抗小鼠Foxp3抗體(1∶1 000 CST)、兔抗小鼠HO-1抗體(1∶200，SNATA)、兔抗小鼠LIF抗體(1∶100, SNATA)、兔抗小鼠TGF-β1抗體(1∶200, SNATA)、兔抗小鼠IL-6抗體(1∶200，SNATA)4 ℃ 孵育過夜。洗去一抗，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔Ig G(1∶3 000)反應，增強化學發光法顯色，X 線底片曝光顯影。以穩定表達的基因 β-actin作為內參照。

2結果

2.1Treg治療對LPS誘導孕鼠早產發生率的影響

LPS組所有孕鼠均在第2劑量LPS后24 h內出現早產，即孕18 d 7∶00～11∶00早產，早產率為100%; Control組孕鼠均在孕19 d以后分娩，早產率為0%; LPS+PBS組孕鼠均在第2劑量LPS后24 h內出現早產，早產率為100%; LPS+Treg組5只于孕18 d早產, 1例孕19 d分娩，早產率為83%。LPS+Treg組早產率與LPS組和LPS+PBS組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2Treg治療對胎盤組織中Foxp3表達的影響

4組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達在出生時降至最低點，且各組間差異無統計學意義(P>0.05)。LPS組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著低于Control組(P<0.001); LPS+Treg組Foxp3 mRNA和蛋白水平的表達在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著高于LPS組和LPS+PBS 組(P<0.001)，與Control組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

**P<0.01, ***P<0.001, ****P< 0.0001

圖1胎盤組織Foxp3 mRNA 和蛋白水平的表達

2.3Treg治療對胎盤組織中HO-1、LIF表達的影響

LPS組胎盤組織HO-1、LIF mRNA和蛋白水平表達在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著低于Control組(P<0.001); LPS+Treg組HO-1、LIF的mRNA和蛋白水平表達在第2劑LPS注射后1、6、12 h均顯著高于LPS組和 LPS+PBS 組(P<0.05), 與Control組差異無統計學意義(P>0.05)。在出生時HO-1、LIF的表達各組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4Treg治療對胎盤組織IL-6表達的影響

LPS組和LPS+PBS組胎盤組織IL-6 mRNA和蛋白質的表達在1、6、12 h和出生時均顯著高于對照組(P<0.01); LPS+Treg組IL-6 mRNA和蛋白質的表達1、6、12 h和出生時顯著低于LPS組和LPS+PBS組(P<0.05，P<0.01); 而與Control組在各時間點的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

3討論

目前國內外關于Treg在妊娠中作用的研究絕大部分是以小鼠自發性早產模型為研究對象，而對于導致早產的最主要原因，即宮內感染誘導早產的發生機制研究很少。為探討LPS誘導小鼠早產時Treg的作用和功能，本研究利用雜交孕17 d的Balb/C小鼠成功構建LPS誘導的早產模型，以雜交孕14 d的Balb/C小鼠脾臟的Treg作為干預手段，觀察不同組別、時間點胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF及IL-6的表達。本研究發現，LPS腹腔注射誘導早產時，胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF mRNA 和蛋白的表達均明顯低于對照組，并且這些指標在LPS干預后6 h開始降低，12 h至最低，與出生時比較差異有統計學意義，這一結果與早產發生的時間基本一致。LPS組在第2劑LPS干預后12 h，即孕18 d 早上5時沒有發生早產，但于孕18 d 7∶00～11∶00開始出現早產; Treg細胞在第1劑LPS腹腔注射前1 h通過尾靜脈注入孕鼠體內，LPS+Treg組胎盤組織Foxp3、HO-1、LIF mRNA和蛋白的表達均明顯高于LPS組，但并未降低LPS誘導的早產率。這可能是由于：首先Treg在妊娠中的起源、擴增、遷移及功能是非常復雜的[8-9]，妊娠時許多免疫細胞如母胎界面的T細胞、B細胞、DC細胞及巨噬細胞被激活后產生趨化因子，參與Treg的遷移和免疫調節功能的發揮；其次，已有實驗[10]證明Treg對于胎盤植入是具有關鍵作用，而Treg治療對于懷孕后4～5 d的小鼠早產模型是無效的；再者，宮內感染導致的早產是非常復雜的免疫反應。因此，不能把研究Treg在LPS誘導早產的功能僅僅局限在觀察它對早產率的影響上。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

圖3胎盤組織 IL-6 mRNA 和蛋白水平的表達

IL-6是一種多功能的細胞因子，在許多炎癥情況下IL-6都作為關鍵的炎性因子表達上調，羊水中IL-6表達增高與早產兒腦損傷密切相關；另一方面，IL-6也可作為抑制炎癥反應的細胞因子，抑制某些自身免疫性疾病的炎癥反應[11-12]。LIF是一種具有多種生物學功能的分泌型糖蛋白，它可以調節免疫反應，保護細胞，防止組織損傷[12], 人類和鼠類實驗證明，LIF在胎盤著床期間起著重要作用[13]，它的正常表達與胎盤的成功植入有關[14]。HO-1作為唯一的誘導型的HO，它分解血紅色為一氧化碳(CO)、膽綠素和游離鐵，CO和膽紅素(膽綠素的分解產物)均有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及細胞保護作用[15-16]。Zenclussen等[17]發現在流產小鼠的胎盤HO-1表達明顯降低，而且HO-1表達減少與早期胚胎死亡有關。若母胎界面HO-1表達減少，就會導致血紅素增多，其中大部分血紅素進入內皮細胞引起氧化損傷，促進黏附分子的產生，減少CO的產生，低水平表達的CO可以通過促進抗炎基因的表達和抑制抗炎因子的產生而擴大炎癥反應。本研究發現LPS腹腔注射可引起胎盤組織炎癥反應，導致Foxp3、HO-1、LIF表達降低，IL-6表達增高，這可能是LPS誘導早產發生的機制之一。而Treg治療后Foxp3、HO-1、LIF表達增高，IL-6表達降低，胎盤組織的炎癥反應減輕。但這是否有益于機體，還需要大量的研究，一方面, Treg參與機體對抗病原體的免疫反應的利弊，與病原體的種類、參與的時間點以及急性或慢性感染有關；另一方面, Treg在感染過程中起到雙重作用，它參與了多數或全部的宿主對病原體感染的免疫反應，抑制過度免疫反應造成的組織損傷，這在多數慢性感染中對宿主是有利的，但其也會抑制宿主對病原體感染發揮有效的保護性免疫反應，不利于宿主對病原體的及時清除。

綜上所述，在LPS腹腔注射誘導的早產小鼠中，Treg參與了宮內感染誘導早產的發生機制、胎盤組織HO-1、LIF參與了Treg在母胎界面維持的獨特的免疫微環境；Treg體內注射可以減少宮內感染導致的炎癥反應，為深入了解宮內感染誘導早產的發生機制提供了新方向，為治療宮內感染導致的炎癥反應開闊了新思路。

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Effect of regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide-induced preterm delivery mouse models

WANG Fan, LIN Xiaojie, XIAO Mi, CHEN Rujuan, Muhammad Siddiq, LIU Li

(DepartmentofNeonatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi, 710061)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of the regulatory T cells on placental inflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced preterm delivery mouse models. MethodsThe 17-day-old pregnant mice were divided into phosphate buffer saline (PBS) group (control group) with intraperitoneal injection of PBS, LPS group with intraperitoneal injection of LPS, LPS+PBS group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS, and LPS+Treg group with intraperitoneal injection of LPS and tail vein injection of PBS. LPS-induced preterm delivery models of 17-day-old pregnant mice were established. Placenta tissues were taken for detecting the expression levels of forkhead/winged helix transcription factor (Foxp3), leukemia inhibitory factor (LIF), heme oxygenase-1 (HO-1) and interleukin 6 (IL-6) 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ResultsPremature delivery rate was 100% in LPS group and 0% in control group. There was no significant difference between LPS+Treg group and LPS+PBS group (P>0.05). The expression levels of Foxp3, HO-1, and LIF decreased significantly, while the level of IL-6 increased significantly in LPS group and LPS+PBS group. The expression levels of Foxp3, HO-1, LIF increased significantly in LPS+Treg group, and the expression level of IL-6 decreased significantly 1, 6, 12 h after the second injection of LPS and at birth. ConclusionIn LPS-induced preterm delivery mouse models, decreasing of the placenta tissue Tregs might be one of mechanisms of premature delivery, HO-1 and LIF participate in the unique immune microenviroment kept by Tregs in maternal-fetal interface. Tregs adoptive therapy can relieve the inflammation reaction of placenta tissue by lowering the expression level of IL-6.

KEYWORDS:forkhead/winged helix transcription factor; lipopolysaccharide; placenta; mouse model

中圖分類號:R 321.4

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)07-010-05

DOI:10.7619/jcmp.201607003

通信作者:劉俐, E-mail: 2432713939@qq. com

基金項目:中國高校醫學期刊臨床專項資金(11525914)

收稿日期:2015-12-11