口蹄疫病毒病原生物學研究

謝豐權 何浩 曾玉梅 朱庭俊

摘要：本文主要介紹了口蹄疫病毒病原生物學的特性及口蹄疫抗原位點研究進展，使其對該病的防控、凈化提供理論依據，對綠色健康發展養殖，確保畜產品質量安全，保護人們生命安全起到積極的作用。

關鍵詞：口蹄疫；病毒；研究

中圖分類號： S852.5 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.15.033

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由具有抗原易變性、血清多樣性的口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。病畜主要表現為口、舌、唇、蹄、乳房等部位發生水皰和潰爛，造成行動與飲食不便，從而導致發育遲緩，該病具有易感動物種類繁多、傳播途徑多樣、四季均可發病等特點，死亡率很低，一般在2.5%左右，但發病率卻可達到100%。如果是犢牛或仔豬發病，其死亡率可高達65%。從口蹄疫病毒的特點來說，口蹄疫病毒可以依附在空氣中的塵埃上，隨風轉移，可以出現跨越幾十公里的疾病流行，如果控制不好，就有可能導致局部地區的大流行，甚至能形成大規模流行。

1病毒分類及理化特性

口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科（picornaviridae）口蹄疫病毒屬（aphthovirus）。口蹄疫病毒呈球形，沒有囊膜，直徑大約30nm。口蹄疫病毒粒子結構比較簡單，是由單股的核糖核酸和蛋白質所組成。在病畜的水皰皮內及淋巴液中，口蹄疫病毒的含量是最高的，致病力也很強。口蹄疫病毒有7個主型，分別是：O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型和亞洲1型，口蹄疫病毒容易發生變異，在這個7個主型之下，至少還可以分為83個亞型，口蹄疫的不同型之間沒有交叉免疫保護性，并且同型的口蹄疫的亞型之間也只有部分的交叉免疫保護性，所以這就給口蹄疫的防控帶來了一定困難。

在自然條件下，含口蹄疫病毒的組織和被污染的飼料、飼喂用具以及土壤等都可以使口蹄疫病毒達到數周到數月的傳染性。在低溫和有蛋白質保護的條件下，能夠幫助延長病毒的存活時間。但是口蹄疫病毒對日光和酸堿比較敏感，當日光直射1小時后病毒就可以死亡，pH低于6.0或者高于9.0時，口蹄疫病毒能很快被滅活。因此對口蹄疫消毒效果好的消毒劑為1%～2%的氫氧化鈉，1%～2%的甲醛溶液，3%的草木灰等，但有些消毒劑對口蹄疫病毒也沒有消毒的作用，例如酚、酒精、氯仿等消毒劑。

2病毒粒子結構

口蹄疫病毒粒子為正二十面體對稱的球形，病毒粒子的直徑為20～30nm，分子量6.9×106道爾頓，對酸堿敏感，沉降系數146S，沒有囊膜。在CsCI中的浮密度為1.43克/毫升。病毒衣殼蛋白含有少量在病毒蛋白裝配過程中夾帶的宿主細胞肌動蛋白和非結構蛋白。其病毒粒子主要有四種衣殼蛋白VP1、VP2、VP3、VP4各60個拷貝組成。

3病毒基因組結構

口蹄疫病毒是正鏈單股的RNA 病毒，屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，總共有7個血清型（王永錄等2010）。其基因組包括2個非翻譯區（UTR）和1個開放閱讀框（ORF）。5′-UTR包括了內部核糖體進入位點（IRES）、假結節（PKs）、多聚C（Polyc）和S片段（S fragment），3′-端包括了3′-UTR 和多聚腺苷酸尾（PolyA）（Mason PW等2003）。雖然已經有很多的研究都報道過口蹄疫病毒的基因組，但是對口蹄疫基因組仍然還有很多的區域的功能沒有得到完全的解釋（張永光等2009）。ORF編碼1個大的多聚蛋白，翻譯為1個前體蛋白，最后水解為12種成熟的蛋白，其為L、1A（Vp4）、1B（Vp2）、1C（Vp3）、1D（Vp1）、2A、2B、2C、3A、3B（Vpg）、3C（Pro）和3D（Pol）（Baranowski E等，2002）。雖然對口蹄疫病毒的復制過程進行過大量的研究，但是仍然還不清楚病毒確切的復制機制（Steil B P等2004，Barton D J等2009）。5′-UTR中的對于S片段怎么會是所有小RNA病毒科中最長的片段，主要是還不大透徹它具體參與RNA復制的機制等（Murray K E等2001，O′Donnell B J等2001）。而且人們對2B和3A的具體作用也還不了解（Pacheco J M等2003），所以如果仔細地去分析口蹄疫全基因組序列的一系列的特征等工作，就可以幫助我們更好、更深入地認識口蹄疫病毒生命活動的相關機制，例如口蹄疫病毒的翻譯和復制等。

4 口蹄疫病毒主要蛋白及功能

P1是口蹄疫病毒的結構蛋白前體，P1最終裂解成4種結構蛋白VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）（宋帥等，2010），這四種結構蛋白各自由60個拷貝組成口蹄疫病毒的衣殼蛋白。口蹄疫病毒感染宿主后病毒RNA被翻譯成為單股長的開放讀碼框，從而形成一個多聚蛋白。Lprβ會抑制宿主mRNA的翻譯，切斷了宿主的蛋白質的合成，同時也包括了干擾素β/α的mRNA，因此減少或者說阻止了對病毒感染的自身免疫應答的能力。實驗表明Lpro還是引起發病的因素中的非常重要的因素。L蛋白在病毒的致病過程中也起到了相當重要的作用。3種病毒編碼的蛋白酶leader（Lpro），2A和3Cpro將多聚蛋白裂解成為四種結構蛋白和很多種非結構蛋白，在病毒的復制周期中起到了特別重要的作用（Grubman M J，2003；Kleina L G ，1992），經翻譯所產生的第一個蛋白，即Lpro，是一種類似于木瓜蛋白酶的物質（Kleina L G，1992；Rieder E，1995；Robert s P J，1995；Guarne A，1998），它從多聚蛋白前體上切割下來之后，又切割了宿主的翻譯起始因子eIF—4G，從而來切斷宿主依賴性帽子mRNA 的翻譯（Devaney M A，1988；Kirchweger R，1994；Domingo E，1993；Strebel K，1986）。

一個結構非常穩定的、特別長的G-H環位于VP1第140-160位的氨基酸處，此環上的氨基酸的構成能夠刺激正在免疫應答的T、B細胞的抗原表位，也稱作病毒表面的主要抗原位點，在其頂部形成了一個供宿主細胞的受體與口蹄疫病毒相結合的位點高度保守Arg-Gly-Asp（RGD）序列（Baxt B，2004；Sobrino F，2001）。VP1蛋白是口蹄疫病毒中的主要的結構蛋白，它位于衣殼的表面，主要的作用就是刺激動物機體產生特異性抗體。

DC是到目前為止已知的功能最強大的專職性的抗原提呈細胞，并且還能激活CD8+T細胞，具體是以交叉途徑來提呈非復制性的抗原，從而發揮對病原體的強烈的殺傷作用（Valladeau J，2002）。基因轉染的DC可以激活CD8+T細胞的產生（IFN K losterm ann B，2004），并且還能誘導CD4+T細胞產生更多的Th1型細胞因子，所以基于DC的基因工程的研究已經成為了抗病毒免疫的一個非常熱點問題（Bellinghausen I，2007）。口蹄疫病毒中能夠惟一產生中和抗體的最重要的結構蛋白就是VP1蛋白，它主要是以突起的形式暴露在病毒粒子的表面，在免疫應答中將會發揮主要的并且必不可少的作用（Abu-Ghazaleh R ，1993）。也有其他的相關報道表示，DC在機體抗口蹄疫病毒感染免疫中發揮著很重要的作用（Wang X， etal，2008），但是野毒的感染可能會嚴重地損傷DC的功能。

5 口蹄疫抗原位點研究進展

5.1 T細胞和B細胞抗原位點

口蹄疫病毒的VP1G-H環內，有激發產生Th細胞的位點，也有誘導生成B細胞的位點，很多實驗結果發現了在 VP41aa～209aa殘基位上至少存在著11個不同的T 細胞表位。口蹄疫病毒感染機體產生中和性抗體需要B細胞和T細胞的參與，感染口蹄疫病毒的小鼠血清中既存在T細胞依賴性IgG1和IgG2 ，也存在非T細胞依IgG3，由此表明T細胞在口蹄疫病毒的抗原構成和免疫應答中起著非常重要的作用（Zhang HY等2003）。Sanz-ParraA（2001）通過試驗發現，含有T細胞表位的多肽能協同誘導機體產生相應的抗病毒抗體，并且能同時增強Th細胞的活性。Zhang ZY等（2003）試驗發現，含有Asia1型口蹄疫病毒的B細胞和T細胞表位的融合蛋白，能引起豚鼠免疫反應，該融合表位給抗Asia1型口蹄疫病毒提供了很好的選擇。

5.2口蹄疫病毒抗原位點

口蹄疫病毒有A、C、O、Asia1（亞洲Ⅰ型）、SAT1、SAT2和SAT3型等7個血清型， O型、C型、A型和Asia1型是研究最多的幾個血清型。

5.2.1 O型口蹄疫病毒 由VP1的G-H環和C端氨基酸殘基的線性表位組成了位點1，從病毒中分離的VP1能夠誘導動物產生相應的中和性抗體，口蹄疫病毒最重要的抗原位點即為該位點，也是口蹄疫病毒抗原變異的關鍵所在。至少有5個中和性抗原位點（Barnett PV等2002）。位于五重軸周圍VP3的B-B 結節上的為位點4。位于VP1的G-H環內，和位點1相互獨立的為位點5。位于病毒表面VP2的E-F環和B-C環上的位點2，在三重軸的附近，由4個表位所組成。位于病毒表面五重軸周圍VP1的B-C環的為位點3。它們的功能都是非常獨立的，但在單拓撲結構上有可能會重疊。抗體競爭的試驗表明，在拓撲結構上來說，位點1、2和3都是獨立的，位點2和4是有關聯的。

5.2.2 C型口蹄疫病毒 HernandezJ等（1994）報道， 位于VP1中的G-H環上的由多個連續的表位所組成是位點A，它包含了一個高度保守的RGD基序 。位于1D的C端末端（大概15個殘基），是一個小而且相對獨立的抗原位點是位點C。位于衣殼蛋白三重軸周圍的一個不連續的抗原區上面的是位點D， 這是一個非常重要的抗原位點，包括了VP1、重要VP2（ B-C環） 和VP3（ B-B結節） 的殘基。另一個獨立的抗原位點接近于衣殼的五重軸，由1D的βH-I環和1D的βB-C環環所組成。所以，一共有4個抗原位點。

5.2.3 A型口蹄疫病毒 應用了不同的A型口蹄疫病毒的株系，不同的研究者就得出了不同的結果。在株系的A5Spain株有2個中和抗原位點，分別位于VP1的C端和VP2上。BlakemoreW等（1996）對A22Iraq株的抗原微點進行了分析。主要有2個主要的位點和2個較次要的位點構成了A10口蹄疫病毒，VP1的140～160序列被包含于第1個主要位點里，對胰酶很敏感，對胰酶不敏感的包含了主要的VP3殘基是第2個主要位點，分別位于VP1的C端和靠近于VP1的169位的是2個次要位點（Woortmeijer RJ，1988）。

通過以上概述讓我們了解了口蹄疫病毒病原生物學的特性，這為我國對該病的防控、凈化提供理論依據，對倡導綠色健康養殖確保畜產品安全，保護人們生命安全起著積極的作用。

作者簡介：謝豐權，大專學歷，重慶市榮昌區廣順街道畜牧獸醫站，獸醫師，研究方向：動物疫病預防控制。