Dickkopf—1在肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中的表達(dá)和臨床意義

曾慶哲 張浩清 楊瑞青

[摘要] 目的 分析Dickkopf-1（DKK-1）在良惡性胸腔積液中的表達(dá)，探討其在鑒別胸水良惡性和判斷預(yù)后中的價(jià)值。 方法 分別用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法和放射免疫法檢測(cè)2010年4月～2012年9月阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院收治的56例肺癌相關(guān)惡性胸腔積液和41例良性胸腔積液患者胸水中DKK-1和癌胚抗原（CEA）水平。 結(jié)果 肺癌相關(guān)惡性胸腔積液DKK-1水平為（43.9±19.4）ng/mL，顯著高于良性胸腔積液的（18.5±8.6）ng/mL（P < 0.01）；肺癌相關(guān)惡性胸腔積液的CEA水平為8.57（5.22，13.08）ng/mL，亦高于良性胸腔積液的3.46（2.49，5.10）ng/mL（P < 0.01）；異常升高的DKK-1與腫瘤分期有關(guān)，而CEA升高與腫瘤病理性質(zhì)有關(guān)；ROC曲線分析顯示DKK-1升高最佳臨界值為36.3 ng/mL，對(duì)于診斷惡性胸腔積液的靈敏度和特異度分別為68.7%和73.5%；而CEA的靈敏度和特異度依次為60.4%和77.2%，CEA與DKK-1聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，靈敏度和特異度可提高至77.2%和80.4%。在肺癌相關(guān)惡性胸腔積液患者中，DKK-1<43.9 ng/mL患者3年總生存率為42.85%，高于DKK-1≥43.9 ng/mL的患者（21.42%）（P < 0.05）。 結(jié)論 Dickkopf-1在肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中明顯升高，了解Dickkopf-1水平有助于鑒別胸水性質(zhì)并協(xié)助判斷總體預(yù)后，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 胸腔積液；DKK-1；癌胚抗原；鑒別

[中圖分類號(hào)] R561 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（b）-0108-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of Dickkopf-1 （DKK-1） in benign and malignant pleural effusion， and to investigate the value of it in identifying benign and malignant pleural effusion and judging the overall prognosis. Methods Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） and radio-immunity method was conducted to detect the value of DKK-1 and carcino-embryonic antigen （CEA） in 56 cases of patients with malignant pleural effusion associated with lung cancer and 41 cases with benign pleural effusions admitted to the First People's Hospital of Fuyang City from April 2010 to September 2012. Results The content of DKK-1 in malignant pleural effusion was （43.9±19.4） ng/mL， which was significantly higher than that of benign pleural effusion [（18.5±8.6） ng/mL] （P < 0.01）； in addition， the value of CEA in malignant pleural effusion was 8.57 （5.22， 13.08） ng/mL， which was also significantly higher than that of benign pleural effusion [3.46 （2.49， 5.10） ng/mL] （P < 0.01）. The abnormally raised DKK-1 was associated with tumor stage， while CEA was associated with tumor pathological nature. ROC curve analysis showed that the best threshold of DKK-1 was 36.3 ng/mL， the sensitivity and specificity were 68.7% and 73.5% respectively in diagnosis of malignant pleural effusion. What's more， the sensitivity and specificity of CEA were 60.4% and 77.2%， while it could be elevated to 77.2% and 80.4% when DKK-1 and CEA were used together. In the patients with malignant pleural effusion associated with lung cancer， the 3 years overall survival rate in DKK-1<43.9 ng/mL patients was 42.85%， which was significantly higher than that of DKK-1≥43.9 ng/mL patients （21.42%） （P < 0.05）. Conclusion The value of Dickkopf-1 is obviously raised in malignant pleural effusion associated with lung cancer， knowing about Dickkopf-1 is helpful to identify the properties of pleural fluid and judge the overall prognosis， which has a certain application value in clinical practice.

[Key words] Pleural effusion； Dickkopf-1； Carcino-embryonic antigen； Identification

Dickkopf（DKK）家族是Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要調(diào)節(jié)因子，它們通過(guò)調(diào)控Wnt通路的下游基因活性而發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。Dickkopf-1（DKK-1）是DKK家族中的一員[1]，研究證實(shí)，DKK-1通過(guò)結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6，產(chǎn)生抑制Wnt下游信號(hào)傳導(dǎo)通路效應(yīng)，發(fā)揮抑制腫瘤增殖分化作用[2]。DKK-1已經(jīng)證實(shí)在肺癌、大腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤組織以及血清樣本中表達(dá)異常[3-5]，但是關(guān)于惡性胸水中的含量以及臨床意義的研究仍然十分少見(jiàn)。本研究旨在分析良惡性胸水中DKK-1的表達(dá)以及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月～2012年9月阜陽(yáng)市第一人民醫(yī)院收治的胸腔積液患者97例，男58例，女39例，年齡22～75歲，平均（52.8±10.1）歲。所有患者均明確診斷為惡性或良性胸腔積液，符合2014年版《惡性胸腔積液診斷與治療專家共識(shí)》[6]意見(jiàn)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中惡性胸腔積液患者56例，男31例，女25例；年齡34～75歲，平均（54.9±9.7）歲；病因均為肺癌；TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例。良性胸腔積液41例，男27例，女14例，年齡（49.9±10.3）歲。

1.2 樣本采集及檢測(cè)

所有患者入院后行胸腔穿刺，留取胸水10 mL，離心半徑6 cm，3000 r/min離心15 min后留取上清液4 mL，分裝2管，置于-20℃冰箱保存待檢。DKK-1含量由ELISA法測(cè)得，試劑購(gòu)于美國(guó)R&D公司，按照吸光度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）由Beckman全自動(dòng)生化分析儀行放射免疫法檢測(cè)。CEA>5 ng/mL為異常升高，DKK-1界值由受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）的方法獲得。

1.3 隨訪

對(duì)56例肺癌相關(guān)胸腔積液患者進(jìn)行定期隨訪，每月至少1次，了解患者生存情況，記錄生存時(shí)間。隨訪起點(diǎn)為確診當(dāng)日，隨訪期限3年，死亡患者自動(dòng)終止隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（QL，QU）]表示，采取Wilconxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。DKK-1和CEA在鑒別良惡性胸水中的價(jià)值由ROC曲線評(píng)估，生存分析采用Kaplan-Meier方法，生存時(shí)間差異采用Log-rank檢驗(yàn)。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性質(zhì)胸水中DKK-1和CEA含量比較

肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中DKK-1和CEA水平明顯高于良性胸水，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 DKK-1和CEA鑒別良惡性胸水的價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，DKK-1診斷肺癌相關(guān)惡性胸腔積液的曲線下面積（area under cuver，AUC）為0.706（0.600，0.813），對(duì)應(yīng)最佳靈敏度和特異度依次為68.7%和73.5%，此時(shí)DKK-1升高的最佳臨界值為36.3 ng/mL。

曲線中，CEA的AUC為0.625（0.541，0.736），與DKK-1比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；CEA鑒別良惡性胸水的最優(yōu)靈敏度和特異度為60.4%和77.2%。結(jié)果顯示，DKK-1診斷肺癌相關(guān)惡性胸腔積液的靈敏度占優(yōu)，但特異性不及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA。當(dāng)兩者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，靈敏度和特異度可提高至77.2%和80.4%。見(jiàn)圖1。

2.3 DKK-1和CEA含量與腫瘤臨床病理的相關(guān)性

DKK-1升高與腫瘤分期有關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期患者DKK-1水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P < 0.05）。而CEA升高與腫瘤病理性質(zhì)有關(guān)，CEA升高患者中腺癌比重最高（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 DKK-1判斷肺癌相關(guān)惡性胸腔積液患者預(yù)后的價(jià)值

隨訪期間，共2例患者失訪，其余54例患者均完成隨訪，失訪率為3.57%。根據(jù)表1結(jié)果，54例肺癌相關(guān)惡性胸腔積液患者胸水中DKK-1平均水平為43.9 ng/mL，以平均水平為分界線，將54例患者分為DKK-1<43.9 ng/mL組和DKK-1≥43.9 ng/mL組，每組27例。DKK-1<43.9 ng/mL組中位生存時(shí)間為28個(gè)月（95%CI：26.2～29.7個(gè)月），長(zhǎng)于DKK-1≥43.9 ng/mL組中位生存時(shí)間為20個(gè)月（95%CI：18.6～21.3個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。DKK-1<43.9 ng/mL組3年總生存率為42.85%，亦高于DKK-1≥43.9 ng/mL的21.42%（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

Wnt-β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤基因表達(dá)異常的重要通路，大量調(diào)節(jié)細(xì)胞分化成熟、增殖、突變的基因通過(guò)該通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。研究提示，大多數(shù)腫瘤患者Wnt-β-catenin信號(hào)通路異常激活，細(xì)胞分化異常，增殖速度加快，表現(xiàn)為無(wú)休止的“歪曲生長(zhǎng)”，而這些特征在Wnt通路失活后可以得到顯著抑制[8-9]。Wnt信號(hào)通路有一系列調(diào)節(jié)因子，調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)的活化與抑制，DKK家族中的DKK-1既是其中之一。

現(xiàn)已明確，DKK-1是β-catenin下游靶基因，通過(guò)結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6，產(chǎn)生抑制Wnt下游信號(hào)傳導(dǎo)通路效應(yīng)，發(fā)揮抑制腫瘤增殖分化作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1在肝癌[11]、肺癌[12-13]、結(jié)腸癌[14]、鼻咽癌[15]等多種腫瘤中表達(dá)異常，且有學(xué)者認(rèn)為，大腸癌細(xì)胞核DKK-1基因表達(dá)上調(diào)，DKK-1升高的患者對(duì)化療藥物敏感性差，總體生存率、無(wú)瘤生存率不佳，了解DKK-1水平有助于判斷預(yù)后[16]。徐吟亞[17]指出，肺癌患者血清DKK-1明顯升高，DKK-1可以用于肺癌診斷和了解有無(wú)骨骼轉(zhuǎn)移。除此之外，DKK-1還和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲活性有關(guān)[18-22]，DKK-1還能抑制腫瘤血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）[23]。由此可見(jiàn)，測(cè)定組織、血清、體液中DKK-1的表達(dá)量對(duì)于了解腫瘤患者生理狀態(tài)意義顯著。但是，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)于胸水中DKK-1水平以及鑒定胸水性質(zhì)的研究仍十分少見(jiàn)。

本研究中，56例肺癌相關(guān)惡性胸腔積液中的DKK-1水平為（43.9±19.4）ng/mL，明顯高于良性疾病所致的胸腔積液（P < 0.05）。異常升高的DKK-1與腫瘤分期有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期患者DKK-1水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P < 0.05），筆者推測(cè)，這可能與進(jìn)展期腫瘤細(xì)胞侵襲范圍更廣、胸水中脫落細(xì)胞增多以及血清擴(kuò)散DKK-1量大有關(guān)，所以了解DKK-1水平還有助于判斷疾病的進(jìn)展階段。

為了探討DKK-1在鑒別良惡性胸水中的價(jià)值，筆者引入ROC曲線的方法進(jìn)行分析。本組研究中，DKK-1和傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA的AUC均超過(guò)0.7，且無(wú)明顯差異（P > 0.05），提示兩項(xiàng)指標(biāo)均具有可靠的診斷價(jià)值。進(jìn)一步分析敏感性和特異性，結(jié)果顯示，DKK-1診斷惡性胸腔積液的敏感性為68.7%，優(yōu)于CEA的敏感性60.4%，但是，特異性不及傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA（73.5%比77.2%）。當(dāng)兩者聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，敏感性和特異性可提高至77.2%和80.4%，較兩者單獨(dú)運(yùn)用時(shí)明顯升高。所以，在臨床上為了更加準(zhǔn)確地鑒別惡性胸水，筆者建議將DKK-1和CEA聯(lián)合檢測(cè)，彌補(bǔ)雙方的缺陷。

本研究還對(duì)56例肺癌相關(guān)性惡性胸腔積液的患者進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)總體生存時(shí)間和生存率差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DKK-1<43.9 ng/mL組中位生存時(shí)間和3年總體生存率優(yōu)于DKK-1≥43.9 ng/mL組患者。如前所述，DKK-1水平與肺癌患者臨床分期有關(guān)，因此推測(cè)，造成DKK-1<43.9 ng/mL組患者預(yù)后相對(duì)較好的原因與患者疾病分期較早有關(guān)，而DKK-1≥43.9 ng/mL的肺癌患者多數(shù)進(jìn)入中晚期，總體預(yù)后不良。所以，當(dāng)肺癌相關(guān)性惡性胸腔積液患者DKK-1水平明顯升高時(shí)，對(duì)提示總體預(yù)后也有一定指導(dǎo)意義，為制訂治療方案提供一定參考。

綜上所述，Dickkopf-1在惡性胸腔積液中明顯升高，了解Dickkopf-1水平有助于鑒別胸水性質(zhì)并協(xié)助判斷總體預(yù)后，可能成為一種新的標(biāo)志物。

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（收稿日期：2015-12-11 本文編輯：張瑜杰）