冠狀動脈粥樣硬化患者細胞因子信號

單雪峰 陳鈾 孫清超

[摘要] 目的 通過檢測冠狀動脈粥樣硬化患者細胞因子信號轉導抑制劑1（SOCS1）基因多態性的表達及外周血中相關細胞因子的含量，來探討SOCS1與細胞因子及左心室射血分數的關系及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生、發展中的作用及臨床意義。 方法 選擇2012年1月～2014年12月新疆醫科大學第一附屬醫院收治的冠心病患者196例為研究組，選擇同期196名健康志愿者作為對照組。利用聚合酶鏈反應及單核苷酸多態性分析兩組SOCS1基因的多態性，同時利用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿中白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、胱抑素C（Cys-C）、同型半胱氨酸（Hcy）的水平。 結果 研究組和對照組rs15677380、rs173516427等位基因頻率比較差異有統計學意義（P < 0.05），rs15677380 C等位基因和rs173516427G等位基因均為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的高危因素（OR = 1.91、1.74），rs173516427和rs15677380不同基因型左心室射血分數和IL-1β、Cys-C差異有統計學意義（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分數最低，IL-1β、Cys-C水平最高。其余各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 SOCS1與冠狀動脈粥樣硬化的發病過程有一定的相關性，可能參與其發病過程。

[關鍵詞] 冠狀動脈粥樣硬化；細胞因子信號轉導抑制劑1；細胞因子；多態性

[中圖分類號] R541.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（b）-0112-05

[Abstract] Objective To explore the relationship of suppressor of cytokine signaling 1 （SOCS1） with cytokines and the left ventricular ejection fraction， and the role they play in the occurrence and development of coronary heart disease by detecting the expression of SOCS1 gene polymorphism and the contents of related cytokines in peripheral blood of patients with atherosclerosis of coronary artery. Methods 196 patients with coronary heart disease admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2012 to December 2014 were chosen as the study group， 196 cases of healthy volunteers at the same time were chosen as control group. Polymerase chain reaction and single nucleotide polymorphism were used to analyze SOCS1 gene polymorphisms of two groups， ELISA method was used to test interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cystatin c （Cys-C） and homocysteine （Hcy） levels in plasma. Results There were significant differences in allele frequencies of rs15677380 and rs173516427 between study group and control group （P < 0.05）， rs15677380 C allele and rs173516427G alleles were the risk factors of coronary atherosclerotic heart disease （OR = 1.91， 1.74）. There were statistically significant differences in left ventricular ejection fraction， IL-1β and Cys-C between rs173516427 and rs15677380 （P < 0.05）， among which， the left ventricular ejection fraction of rs173516427 G/G genotype and rs15677380 C/C genotype were the lowest， whereas the IL-1β and Cys-C levels of these genotype were the highest. There were no significant differences between the other groups （P > 0.05）. Conclusion There is a certain relationship between the SOCS1 and pathogenesis of atherosclerosis of coronary artery， SOCS1 may take part in the pathogenesis of disease.

[Key words] Atherosclerosis of coronary artery； Suppressor of cytokine signaling 1； Cytokines； Polymorphism

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病的發病率和病死率逐年升高，并有年輕化和加速的趨勢，已成為我國居民健康的“頭號殺手”[1]，因此，對于心血管疾病的早期診斷和治療是目前醫務工作者面臨的重要任務。動脈粥樣硬化是引起心血管疾病的重要原因，研究提示[2]，它是一種由多因素引起的復雜的慢性炎癥免疫反應過程，固有免疫與獲得性免疫貫穿于動脈粥樣硬化發生發展的全過程及并發癥出現的各個階段。細胞因子信號轉導抑制劑1（SOCS1）是固有免疫和獲得性免疫的重要生理性調節因子，能夠調節淋巴細胞的激活發育和分化，并致使人γ干擾素（IFN-γ）等炎癥因子的分泌減少，起到抑炎的作用[3]，通過酪氨酸蛋白激酶/信號轉導子和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路作用與T淋巴細胞、樹突細胞和單核巨噬細胞，參與了動脈粥樣硬化的發生發展[4]。此外，基礎及臨床試驗研究發現[5]，炎性反應的增加，一些相關炎癥因子水平的升高，如C反應蛋白、白細胞介素、腫瘤壞死因子等也參與了動脈粥樣硬化的發生發展，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的重要危險因素。本研究通過檢測冠狀動脈粥樣硬化患者SOCS1基因多態性的表達及外周血中白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、胱抑素C（Cys-C）、同型半胱氨酸（Hcy）的含量，來探討SOCS1與細胞因子及左心室射血分數的關系及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生、發展中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2014年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院綜合心內科住院并確診為冠心病的患者為研究組。納入標準：①標準Judkins法行冠狀動脈造影術，計算機定量分析冠狀動脈狹窄程度，判斷陽性標準：前降支、回旋支或右冠脈及其分支中或左主干冠狀動脈直徑狹窄≥50%作為冠心病的診斷標準；②無糖尿病、其他部位的嚴重感染、腫瘤、傳染性疾病、慢性肝腎功能不全及其他自身免疫性疾病；③所有入選者均為首次就診，就診前未服用過他汀類藥物；④所有研究對象均自愿簽署知情同意書。研究組196例，其中男109例，女87例，年齡43～76歲，平均（60.1±11.6）歲。選擇同期健康志愿者作為對照組。對照組共196名，其中男105名，女91名，年齡42～74歲，平均（58.4±11.2）歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究取得醫院倫理委員會的批準，于研究開始前與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 清晨空腹抽取兩管靜脈血，一管血液樣本高溫低速離心，另一管血液樣本采集至EDTA抗凝采血管，-20℃冰箱儲存。

1.2.2 引物的設計與合成 利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，rs173516427上游引物序列5'-GAGAGCTT-CGACTGCCTCTT-3'，下游引物序列為5'-AGGTAGGAGGTGCGAGTYCA-3'，rs15677380上游引物序列為5'-CGCCACTTCTTCACGCTCAG-3'，下游引物序列為5'-AGGGGCCGGCTCAACACC3-3'。

1.2.3 主要試劑 5%Clelex-100（sigma公司，美國）；2×TapPCR Master Mix（上海生工生物工程有限公司）；蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司）；IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy進口分裝的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2.4 主要設備 低溫高速離心機（Thermo公司，美國）；HF-2型全自動酶標儀（anthos公司，奧地利）；HH-501型水浴箱（成都可隆機械設備有限公司）；C1000型PCR擴增儀和GelDoc2000凝膠成像儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2.5 基因組DNA的提取 采用Chelex-100法提取基因組DNA，取200 μL完全解凍并加入EDTA抗凝劑的全血，加入20 μL（20 mg/mL）蛋白酶K及150 μL（50 mg/mL）Chelex-100，用移液器反復吹打混勻。然后將EP管置于100℃水浴箱中水浴10 min，冰浴1 min，離心10 min，將上清液移至無菌EP管中，-20℃保存。

1.2.6 采用PCR法檢測樣本DNA PCR總反應體系為25 μL，其中DNA模板8 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Tap PCR Master Mix 12 μL，無菌去離子水補足至總體積25 μL。PCR的擴增條件：95℃ 5 min預變性后，進入主循環，總共35個循環，其中95℃變性30 s，62℃退火1 min，72℃延伸60 s，末次延伸為72℃ 5 min，終止反應。

1.2.7 采用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy 采用ELISA法，用抗人IL-1β、TNF-α、Cys-C、Hcy的單抗包被于酶標板上，然后加入生物素化相應的抗體，最后加入終止液，在相應的波長處測OD值，通過繪制標準曲線求出標本中所測炎癥因子的濃度。

1.2.8 左心室射血分數的檢測 采用美國Philips iE 33彩色多普勒血流儀，由超聲科主任醫師在不知情的情況下對入選者進行超聲心動圖的檢查，并利用面積長軸法測定入選者左心室射血分數的均值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SOCS1基因rs173516427位點PCR-RFLP基因分型結果

SOCS1基因rs173516427位點為A/G兩種基因型，PCR的擴增片段長度為249 bp，限制性內切酶酶切后A/A基因型為52 bp的片段，A/G基因型為197 bp的片段（圖1）。SOCS1基因rs15677380位點為C/T兩種基因型，PCR擴增片段長度為285 bp，限制性內切酶酶切后C/C基因型為91 bp的片段，C/T基因型為194 bp的片段（圖2）。

2.2 兩組SOCS1基因各等位基因頻率的比較

研究組和對照組rs15677380、rs173516427等位基因頻率比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 SOCS1基因各基因型的炎癥因子與左心室射血分數的比較

對研究組2個基因型分別進行分組比較，結果顯示：rs173516427和rs15677380不同基因型左心室射血分數和IL-1β、Cys-C差異有統計學意義（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分數最低，IL-1β、Cys-C水平最高。其余各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）是冠脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起的血管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病[6]。CHD是一種多因素疾病，目前其發病機制尚未完全闡明，近年來隨著研究的不斷深入，發現炎癥免疫反應在動脈粥樣硬化的發生發展中起著重要的作用[7]。CHD是一種自身免疫反應介導的慢性炎癥性疾病，固有免疫與獲得性免疫反應存在于動脈粥樣硬化發生發展及并發癥出現的各個階段[8]。

SOCS是固有免疫和獲得性免疫的重要生理性調節因子[9]。這些因子通過負向調控，負反饋抑制因子調節單核巨噬細胞、樹突細胞及T淋巴細胞的激活、發育和分化而參與免疫性疾病的發生和發展[10]。有關SOCS的研究多集中于SOCS1和SOCS3，國外研究者發現[11]，SOCS1的高表達可以抑制細胞因子介導的STAT的激活以及前炎癥因子的基因表達和細胞的增殖，如IL-1β、IL-6、TNF-α、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）等[12]。SOCS1是人體免疫系統的重要生理調節因子，在正常人體內呈低水平表達，經炎癥細胞因子刺激后可快速誘導表達[13]。國內研究者[14]通過檢測冠心病患者外周血單核細胞SOCS1的表達水平，并通過ELISA法檢測患者血漿中的相關炎癥因子水平發現，SOCS1在冠心病患者中的表達水平明顯增高，相關炎癥因子水平也相應增高，此研究結果提示SOCS1的高表達可能參與了冠心病的發生、發展，其機制可能與冠心病患者體內促炎因子水平的升高有關。Grothusen等[15]將SOCS1與低密度脂蛋白受體同時缺乏的研究組小鼠與對照組小鼠比較發現，經過高脂飲食飼養，研究組小鼠的粥樣斑塊面積、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平明顯高于對照組，充分說明了SOCS1在動脈粥樣硬化的形成發展中發揮著重要作用。本研究結果顯示，冠心病患者SOCS1基因的rs15677380和rs173516427等位基因頻率與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05），與國內谷高玲等[16]的研究一致，進一步提示了SOCS1基因多態性參與了CHD的發生發展。

在CHD的發展過程中，始終有大量的炎癥因子參與其中，炎癥因子升高的水平與心血管事件呈顯著相關。IL-1β和IL-6由多種細胞分泌，并能放大急性炎性反應，使得機體產生慢性炎癥，并處于中心地位[17]。TNF-α具有廣泛生物活性，并被證實存在于動脈粥樣硬化的斑塊中，在動脈粥樣硬化的形成和炎性反應中發揮作用，參與了動脈粥樣硬化的形成[18]。Cys-C是一種表達于所有有核細胞的低分子量非糖基化蛋白質，通過調節半胱氨酸蛋白酶活性，影響中性粒細胞的吞噬與趨化功能，參與炎性反應過程，升高C反應蛋白水平[19]。而炎性反應是動脈粥樣硬化發生發展中的重要因素，因此Cys-C參與了動脈粥樣硬化的形成，并且與斑塊的消退及穩定性相關[20]。本研究發現，研究組患者SOCS1基因rs173516427和rs15677380的不同基因型左心室射血分數和IL-1β、Cys-C水平差異有統計學意義（P < 0.05），其中rs173516427 G/G基因型和rs15677380 C/C基因型的左心室射血分數最低，IL-1β、Cys-C水平最高，因此推測SOCS1可能參與CHD的發生發展，通過影響患者體內促炎因子水平及Cys-C的冠脈血管重塑，使得左心室射血分數水平降低而影響CHD的發展過程。因此，進一步推測SOCS1與CHD的發病過程有一定的相關性，通過上調體內促炎因子水平及負反饋抑制單核細胞的致炎活性，與Cys-C相互作用，影響CHD患者的左心室射血分數，進而參與CHD的發展過程。本研究結果可為動物實驗和臨床治療提供一種新思路。

[參考文獻]

[1] Barseghian A，Gawande D，Bajaj M. Adiponectin and vulnerable atherosclerotic plaques [J]. J Am Coll Cardiol，2011， 57（7）：761-770.

[2] Chen Z，Xu H. Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanism of tanshinone IIA for atherosclerosis [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：267976.

[3] Chen SC，Lin YI，Huang B，et al. Salvianolic acid B suppresses IFN-γ-induced JAK/STATl activation in endothelial cells [J]. Thromb Res，2011，128（6）：560-564.

[4] Kadowaki T，Yamauchi T，Okada-Iwabu M，et al. Adiponectin and its receptors：implica-tions for obesity-associated diseases and longevity [J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2014， 2（1）：8-9.

[5] Sprague AH，Khalil RA. Inflammatory cytokines in vascular dysfunction and vascular disease [J]. Biochem Pharmacol，2009，78（6）：539-552.

[6] Hansson GK. Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease [J]. N Engl Med，2005，352（16）：1685-1695.

[7] Song X，Zhang Z，Wang S，et al. A Janus Kinase in the JAK/STAT signaling path-way from Litopenaeus vannamei is involved in antiviral immunity response [J]. Fish Shellfish Immunol，2015，44（2）：662-673.

[8] Legein B，Temmerman L，Biessen EAL，et al. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis [J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2013，70（20）：3847-3869.

[9] Sygitowicz G，Janas J，Bialek S，et al. Ischaemia modified albumin in patients with acute coronary syndrome and negative cardiac troponin Ⅰ [J]. Scand J Clin Lab Invest，2013，73（2）：130-134.

[10] Kaptoge S，Seshasai SR，Gao P，et al. Inflammatory cytokines and risk of coronary heart disease：new prospective study and updated meta-analysis [J]. Eur Heart J，2014，35（9）：578-589.

[11] Linossi EM，Babon JJ，Hilton DJ，et al. Suppression of cytokine signaling：the SOCS perspective [J]. Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：241-248.

[12] Recio C，Oguiza A，Mallavia B，et al. Gene delivery of suppressors of cytokine signaling（SOCS）inhibits inflammation and atherosclerosis development in mice [J]. Basic Res Cardiol，2015，110（2）：8.

[13] Tran-Thanh D，Arneson NC，Pintilie M，et al. Amplification of the prolactin receptor gene in mammary lobular neoplasia [J]. Breast Cancer Res-Treat，2011，128（1）：31-40.

[14] 向水，董念國，劉金平，等.SOCS1/SOCS3在冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及意義[J].華中科技大學學報：醫學版，2012，41（2）：152-155.

[15] Grothusen C，Schuett H，Hillmer A，et al. Role of suppressor of cytokine signaling-1 in murine atherosclerosis [J]. PloS One，2012，7（12）：e51608.

[16] 谷高玲，趙國安，孫海燕，等.冠心病患者細胞因子信號轉導抑制劑1基因多態性的臨床意義[J].中國醫科大學學報，2013，42（5）：436-450.

[17] Nizamutdinova IT，Kim YM，Jin H，et al. Tanshinone IIA in- hibits TNF-α mediated induction of VCAM-1 but not ICAM-1 through the regulation of GATA-6 and IRF-1 [J]. Int Immunop-harmacol，2012，14（4）：650-657.

[18] 李廣平，李大勇.動脈硬化閉塞癥中醫證候與血清hsCRP、TNF-α表達的研究[J].中華中醫藥學刊，2013，31（8）：1619-1620.

[19] 周月濤，張愛華.血清胱抑素C水平與冠狀動脈粥樣硬化病變嚴重程度的相關性研究[J].疑難病雜志，2011， 10（12）：929.

[20] 劉海燕，楊文東.血清同型半胱氨酸和胱抑素C水平與冠狀動脈病變嚴重程度的相關性[J].檢驗醫學與臨床，2012，9（11）：1328.

（收稿日期：2015-12-09 本文編輯：張瑜杰）