氰尿酸誘導(dǎo)孕鼠形成腎結(jié)石動(dòng)物模型的研究

劉迪 吳希慶 薩音白剛 楊建新

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014000；2.內(nèi)蒙古包鋼第三職工醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014000

[摘要] 目的 研究氰尿酸在孕鼠妊娠期內(nèi)能否形成腎臟結(jié)石，探討氰尿酸對(duì)孕鼠生育的影響。 方法 將氰尿酸劑量按50、100、250、400、550、700 mg/（kg×d）灌胃孕鼠，對(duì)照組灌入蒸餾水，孕鼠生產(chǎn)后停止灌胃。觀察孕鼠的產(chǎn)仔情況，HE染色觀察孕鼠的腎臟組織的病理變化。結(jié)果 400、700 mg/（kg×d）組孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量明顯低于對(duì)照組（P< 0.05）。250、400、550、700 mg/（kg×d）組分別有2、4、5、4只孕鼠在病理切片中可見(jiàn)腎小管、集合管有結(jié)石樣物質(zhì)。 結(jié)論 妊娠期孕鼠灌胃氰尿酸后，高劑量實(shí)驗(yàn)組孕鼠產(chǎn)仔數(shù)量受到明顯抑制；在病理切片中發(fā)現(xiàn)結(jié)石樣物質(zhì)，并隨著劑量的上升加快成石，成功得到了氰尿酸孕鼠腎結(jié)石的模型。

[關(guān)鍵詞] 氰尿酸；腎結(jié)石；孕鼠模型

[中圖分類號(hào)] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）03（b）-0039-04

Study on the Pregnant Rat Model with Kidney Stones Induced by Cyanuric Acid

LIU Di1， WU Xi-qing2， SAYIN Bai-gang2， YANG Jian-xin2

1.Inner Mongolia University of Science and Technology Baotou Medical College， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China； 2.Department of Urinary Surgery， the Third Staff Hospital of Baogang Group， Baotou， Inner Mongolia Autonomous Region， 014000 China

[Abstract] Objective To investigate whether cyanuric acid can cause the formation of kidney stones in pregnant rats and explore the effect of cyanuric acid on the fertility in pregnant rats. Methods The pregnant rats in cyanuric acid gavage group were given intragastric administration of cyanuric acid 50， 100， 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d）， respectively， and those in the control group were given intragastric administration of distilled water. The lavage was stopped after production. The litter situation， pathological changes in the kidney tissue by HE staining in the rats were observed. Results The number of litter in the 400， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group was obviously less than that in the control group， respectively （P<0.05）. Pathological section showed that there were 2， 4， 5， 4 pregnant rats with material like stones in the renal tubule and collecting duct respectively in the 250， 400， 550， 700 mg/（kg·d） pregnant rats group. Conclusion The litter amount in the pregnant rats group with intragastric administration of large-dose cyanuric acid was significantly reduced. Stone-like material was found in the pathological section， and it fast formed the stone with the increase of the dose of cyanuric acid， so the pregnant rat model with kidney stones induced by cyanuric acid was obtained successfully.

[Key words] Cyanuric acid； Kidney stone； Pregnant rat model

氰尿酸，又名三聚氰酸，是一種在工業(yè)上常見(jiàn)的化學(xué)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與三聚氰胺相似，同時(shí)也是生產(chǎn)三聚氰胺過(guò)程中必不可少的化工原料，其主要廣泛應(yīng)用于消毒業(yè)，并被用來(lái)進(jìn)行游泳池的消毒[1]，但是在2007年韓國(guó)及美國(guó)寵物食用飼料死亡事件以及我國(guó)三鹿牌奶粉事件相繼曝光后，三聚氰胺及其結(jié)構(gòu)類似物氰尿酸出現(xiàn)在人們的視野里，在奶粉及動(dòng)物飼料里添加這類物質(zhì)目的是提高蛋白質(zhì)的檢測(cè)含量，目前國(guó)外已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明三聚氰胺與氰尿酸聯(lián)合灌胃老鼠與單獨(dú)灌服三聚氰胺相比，前者對(duì)腎功能的毒性更強(qiáng)，形成泌尿系結(jié)石更快[2]。因此，在對(duì)三聚氰胺進(jìn)行深入研究的同時(shí)，氰尿酸大鼠尿路結(jié)石模型的研究非常有必要，而孕鼠尿路結(jié)石模型的研究在預(yù)防和治療氰尿酸尿路結(jié)石上更有價(jià)值。為探討氰尿酸對(duì)孕鼠生育的影響，該實(shí)驗(yàn)于2015年9月開(kāi)始，同年10月結(jié)束，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本總數(shù)84只。

1 試驗(yàn)材料

1.1 研究對(duì)象、藥物及器材

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠28只，90日齡；SPF級(jí)Wistar雌性大鼠56只，體重（250±20）g，90日齡。大鼠精神狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度恒定，12 h明、暗交替，動(dòng)物可隨意獲取水及食物，所有實(shí)驗(yàn)及護(hù)理過(guò)程遵循我國(guó)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例的指導(dǎo)，并嚴(yán)格遵守動(dòng)物保護(hù)公約及禁止虐待動(dòng)物公約。大鼠及鼠糧均由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供（合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001）。氰尿酸（化學(xué)純，含量>98.0%），分子式為C3H3N3O3。生物顯微鏡：Olympus，日本。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將56只Wistar雌鼠隨機(jī)分為7組（G0-G6）每組8只，對(duì)照組為G0，實(shí)驗(yàn)組為G1-G6 ，28只雄鼠隨機(jī)均分7組，按照雄鼠和雌鼠1：2的比例，將各組的雌鼠和雄鼠隨機(jī)合籠，每籠雄鼠4只，雌鼠8只，早晚檢查陰道栓（為雄鼠精液與雌鼠分泌物混合后風(fēng)干形成）確定受孕情況。

1.3 造模方法

隨機(jī)將雌鼠分成G0-G6共7組，每組8只。氰尿酸灌胃組（G1-G6）按劑量50、100、250、400、550、700 mg/（kg·d）灌胃孕鼠，對(duì)照組G0灌入蒸餾水，均按每只1 mL/100 g灌胃，孕鼠生產(chǎn)后停止灌胃。氰尿酸的灌胃劑量根據(jù)Hodge等給予大鼠灌胃三聚氰酸鈉的劑量為參考[3]。對(duì)照組及氰尿酸灌胃組的雌鼠在確定妊娠后，按照實(shí)驗(yàn)分組分別單獨(dú)喂養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 孕鼠的一般情況及正常產(chǎn)期產(chǎn)下的仔鼠數(shù)量 在開(kāi)始灌胃后，在保證鼠糧及飲用水充足的情況下每天觀察妊娠孕鼠的飲食及飲水量，觀察孕鼠白天和夜晚的精神狀態(tài)；并將正常產(chǎn)期內(nèi)各組孕鼠產(chǎn)下的仔鼠數(shù)量做記錄，將各組孕鼠生產(chǎn)出的仔鼠的數(shù)值求和后取平均數(shù)，再進(jìn)行比較。

1.4.2 孕鼠腎臟病理變化 孕鼠分娩后乙醚麻醉處死雌鼠，并且在無(wú)菌條件下切取腎臟觀察，將雙腎做成病理切片，在顯微鏡下對(duì)腎臟進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理時(shí)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 妊娠雌鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)組Wistar 孕鼠與對(duì)照組比較，未出現(xiàn)脫毛、毛發(fā)直立以及毛發(fā)稀松等現(xiàn)象。G4、G5、G6組與對(duì)照組比較表現(xiàn)出了不愿進(jìn)食、活動(dòng)少，對(duì)周?chē)h(huán)境敏感，容易受到驚嚇，飲水量增多、尿量增加。

2.2 新生仔鼠的總數(shù)及平均數(shù)

在成功受孕并存活的52只孕鼠當(dāng)中，共有47只孕鼠順利分娩產(chǎn)下仔鼠，各組孕鼠分娩出的仔鼠的數(shù)量的總和及平均數(shù)見(jiàn)表1，如表所示，在所有實(shí)驗(yàn)組中，只有M4、M6組的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠數(shù)量與對(duì)照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05） ；其余各組的妊娠孕鼠分娩出的仔鼠與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。

2.3 妊娠雌鼠腎臟病理檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組妊娠孕鼠腎臟的外觀及大小正常，包膜光滑完整，顏色鮮紅，在切開(kāi)腎臟后未見(jiàn)到腎皮質(zhì)和腎髓質(zhì)有明顯異常。腎臟的腎乳頭、腎盞、腎盂等腎臟解剖結(jié)構(gòu)正常，病理切片示無(wú)明顯異常，見(jiàn)圖1。各組孕鼠發(fā)生腎結(jié)石的情況見(jiàn)表2，M3-M6組孕鼠在腎小管內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)石樣物質(zhì)，這些結(jié)石樣物質(zhì)沉積在集合管和腎小管中，見(jiàn)圖2，部分孕鼠腎臟在皮、髓質(zhì)交界處偶可見(jiàn)到點(diǎn)、片狀出血灶，同時(shí)可見(jiàn)上皮細(xì)胞腫脹伴有損傷和脫落，腎實(shí)質(zhì)與對(duì)照組相比萎縮明顯，同時(shí)也可見(jiàn)到部分腎小球萎縮，但未見(jiàn)明顯的腎間質(zhì)纖維化等病理表現(xiàn)。

3 討論

繼2004及2007年寵物死亡事件中飼料檢測(cè)出三聚氰胺后，作為一種新物質(zhì)——氰尿酸浮出水面，研究發(fā)現(xiàn)氰尿酸與三聚氰胺同時(shí)添加時(shí)，其成石率及腎毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)添加其中一種物質(zhì)[4]。Hodge等人的研究[3]，通過(guò)分別給予大鼠、B6C3F1小鼠高劑量三聚氰酸鈉 500～700 mg/kg、2 000～2 200 mg/kg經(jīng)口灌胃，3個(gè)月后在兩種鼠的膀胱里找到了結(jié)石同時(shí)伴有膀胱的上皮細(xì)胞增生。Ji等將混合后的三聚氰胺+氰尿酸（63/6.3 mg/kg）經(jīng)口灌胃實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，發(fā)現(xiàn)混合物對(duì)腎臟等泌尿系器官的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這兩種物質(zhì)的單獨(dú)作用，并于腎臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)晶樣物質(zhì)[4]；而Stine在給妊娠孕鼠攝入三聚氰胺及氰尿酸后，于孕鼠的羊水中檢測(cè)到三聚氰胺及氰尿酸，證實(shí)了三聚氰胺及氰尿酸能夠從動(dòng)物的母體轉(zhuǎn)移到胎兒，對(duì)妊娠期的胎兒產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、死胎等[5]。

Chen通過(guò)給予大鼠灌胃三聚氰胺氰尿酸鹽（1：1）400 mg/kg，12 h后發(fā)現(xiàn)近端小管開(kāi)始變性壞死，48 h后發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟遠(yuǎn)端小管擴(kuò)張并可見(jiàn)少量的黃綠色結(jié)晶，推斷早期腎功能衰竭可能與三聚氰胺氰尿酸鹽堵塞腎小管有關(guān)[6]。Bob的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)腸道中某些種類的克雷伯氏菌例如K.Terrigena可將三聚氰胺分解成氰尿酸，生成的氰尿酸與三聚氰胺相遇后加重了腎臟的損害，并加快了結(jié)石的形成[7]，這說(shuō)明了氰尿酸在成石過(guò)程中扮演著重要的角色。Yin等人的研究還發(fā)現(xiàn)三聚氰胺及其結(jié)構(gòu)類似物對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞有一定的毒性作用[8]。

該研究通過(guò)給妊娠孕鼠灌胃劑量分別為50～700 mg/（kg×d）的氰尿酸后建立了模型組。在實(shí)驗(yàn)研究的過(guò)程中，能夠發(fā)現(xiàn)高劑量組的孕鼠生長(zhǎng)較對(duì)照組雌鼠發(fā)育緩慢，精神狀態(tài)差，不愿活動(dòng)，在灌胃的第9天和第11天氰尿酸灌胃組雌鼠死亡3 只，通過(guò)對(duì)雌鼠的尸體進(jìn)行解剖后研究發(fā)現(xiàn)，雌鼠的胸腔未見(jiàn)積血，未見(jiàn)食管受損或破裂，腎臟內(nèi)可見(jiàn)充血，打開(kāi)胃后可見(jiàn)白色粉狀食糜，雙子宮內(nèi)可見(jiàn)未發(fā)育完全的仔鼠，這說(shuō)明高濃度氰尿酸的攝入可能限制了妊娠雌鼠的正?；顒?dòng)，抑制了仔鼠的發(fā)育，另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣提示與對(duì)照組的孕鼠相比，高劑量氰尿酸灌胃組孕鼠分娩出的仔鼠數(shù)量明顯少于對(duì)照組，同時(shí)在400 mg/kg、550 mg/kg以及700 mg/kg組的病理切片中發(fā)現(xiàn)了結(jié)石樣結(jié)晶，但在700 mg/kg組中的病理切片結(jié)石樣結(jié)晶更加顯著，原因可能是被攝入的氰尿酸劑量增加導(dǎo)致通過(guò)腎臟排泄的氰尿酸濃度上升，相比較低劑量的組更容易形成結(jié)石。另一方面高劑量組與低劑量組相比尿量減少同樣也間接提高了結(jié)晶的濃度。高劑量氰尿酸攝入動(dòng)物體內(nèi)在尿液中出現(xiàn)的結(jié)晶需要經(jīng)腎臟的腎小管排泄，當(dāng)結(jié)晶的量達(dá)到一定程度時(shí)腎小管的負(fù)荷加大，最終可能因?yàn)榻Y(jié)晶沉積堵塞腎小管甚至損傷腎單位，但攝入氰尿酸后在體內(nèi)形成的晶體是否對(duì)腎單位有毒性，目前還不能肯定。

綜上所述，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果說(shuō)明氰尿酸作為三聚氰胺的類似物，對(duì)人類的確有一定的危害，需要我們繼續(xù)對(duì)其研究，目前對(duì)于三聚氰胺、氰尿酸的成石機(jī)制還未完全清楚，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)給妊娠雌鼠灌胃攝入氰尿酸的方法，成功建立了氰尿酸孕鼠尿路結(jié)石的模型，為氰尿酸尿路結(jié)石合并妊娠的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并且應(yīng)用氰尿酸建立孕鼠尿路結(jié)石動(dòng)物模型尚屬首創(chuàng)，類似動(dòng)物模型國(guó)內(nèi)外研究較少，通過(guò)觀察孕鼠的生長(zhǎng)及生產(chǎn)情況，對(duì)預(yù)測(cè)氰尿酸對(duì)妊娠婦女的影響也同樣具有重大意義。

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（收稿日期：2015-12-07）