肺癆康與耐異煙肼結核ahpC基因突變關系的研究

陳歡葉品良張傳濤 等

【摘要】 目的：探討肺癆康對耐異煙肼結核ahpC基因突變的影響。方法：采用全基因重測序的方法，對藥物干預后的耐異煙肼結核模型小鼠肺組織結核桿菌基因組DNA進行重測序。以標準菌株（H37RV）為參考序列，篩選出與ahpC基因相關的突變位點，進行對比分析。結果：7個堿基突變位點的ahpC基因對應的密碼子和氨基酸均未發生改變。肺癆康組和肺癆康聯合異煙肼組的突變位點2729621，對應的密碼子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸變為絲氨酸。結論：肺癆康對ahpC基因突變無修復作用，突變位點2729621，可能是肺癆康干預過的小鼠與未使用肺癆康干預過的小鼠之間的個體差異相關的單核苷酸多態性（SNP）位點。肺癆康抗結核的作用機制，需要參考與異煙肼耐藥相關的其它基因的文獻資料做進一步研究討論。

【關鍵詞】 肺癆康； 耐異煙肼結核； ahpC基因突變

The Research on Relationship between Feilaokang and ahpC Gene Mutation of Isoniazid-resistant Tuberculosis/CHEN Huan，YE Pin-liang，ZHANG Chuan-tao，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（08）：001-004

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Feilaokang on Isoniazid-resistant TB ahpC gene mutation.Method：Used the method of whole genome sequencing after drug intervention of isoniazid resistance tuberculosis mouse with lung tissue tuberculosis DNA analysis.In standard strains （H37RV） as the reference sequence，selected associated with ahpC gene mutations to make a contrastively analyzed.Result：Seven bases of ahpC gene corresponding codon and amino acid had not been changed.The feilaokang group and feilaokang combine isoniazid group 2729621 of gene mutation locus，the corresponding codon Gcc changed to Tcc，by alanine to serine.Conclusion：Feilaokang cant repair ahpC gene mutation locus 2729621 maybe is the single nucleotide polymorphism refer to individual difference between the mouse using feilaokng intervention with the mouse not using feilaokang intervention.The mechanism of feilaokang resistance TB need refer to more gene literature associated with isoniazid resistance to make further researching and discussion.

【Key words】 Feilaokang； Resistant-isoniazid tuberculosis； ahpC mututation

First-authors address：Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China

doi：10.3969/j.issn.1675-4985.2016.08.001

“肺癆康”是在歷代醫家辨治“肺癆”經驗的基礎上，根據臨證經驗不斷總結組成的中藥復方，主要由蒸百部、白及、天門冬、川貝母、北沙參、蛤蚧、阿膠等十一味中藥組成，滋陰清熱，潤肺止咳，抗癆殺蟲。臨床觀察發現，肺癆康可以促進肺部結核部分患者臨床癥狀和肺部體征消失[1]。前期研究發現肺癆康能延長耐多藥結核模型小鼠的存活時間，緩解肝、脾、肺的炎性反應，對耐藥結核分枝桿菌具有明顯的抗菌作用[2-4]。本研究以耐異煙肼結核小鼠模型為研究對象，運用基因組重測序的方法對模型小鼠進行DNA測序，擬證實肺癆康能修復與耐異煙肼耐藥相關的ahpC基因的突變，為探究肺癆康的抗耐異煙肼結核分子機制提供基因依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠120只（購自成都達碩生物科技有限公司，合格證號：SCXK（川）2013-24），雌雄各半，體重18～22 g，檢疫后備用。小鼠自購買后，自由攝食飲水適應性喂養3 d，實驗室環境溫度控制在（25±2）℃。動物標準顆粒飼料購自成都達碩生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物

1.2.1 肺癆康藥液的制備及用量用法 肺癆康方劑中藥物均購自北京同仁堂成都分店。將上述中藥飲片采用傳統方法一次性煎煮完畢。煎煮方法：將除阿膠、蛤蚧外的九味藥物冷水浸泡1 h后煎煮3次，第1次煮沸后煎煮15 min，第2次煮沸后煎煮20 min，第3次煮沸后煎煮30 min，3次過濾的藥液混合，趁熱加入烊化好的阿膠及蛤蚧粉。用電子恒溫水箱60℃低溫將藥液濃縮至含生藥1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存，每日取適量藥液加熱使用。前期實驗得出高劑量肺癆康用量為6 g/kg灌胃時，對耐藥結核治療效果明顯，經過換算后得出體質量20 g的小鼠肺癆康藥液灌胃量約為0.12 mL/d。小鼠每3天稱量一次體重，根據小鼠體重情況增減灌胃的藥液量[3]。

1.2.2 異煙肼液的制備及用量用法 異煙肼片（100 mg/片，沈陽紅旗制藥有限公司生產，國藥準字H21022350，產品批號：201309021）按照成人用量：0.3 g/d，1 次/d[5]。將異煙肼片磨成粉狀，加入蒸餾水，混合均勻。以成人體重70 kg、小鼠體重20 g，按體表面積折算等效量比（成人：小鼠=1∶0.0026）進行計量換算，體重20 g的小鼠給藥量為0.001 54 g/d[6]。將藥物研末后加蒸餾水溶解稀釋100倍，則20 g小鼠灌胃INH藥量約為0.15 mL。

1.2.3 肺癆康聯合異煙肼藥液的制備及用量用法 肺癆康藥液和異煙肼液等體積混合均勻，按6 g/kg體重計算，20 g重的小鼠需給予灌胃約0.12 mL。

1.3 實驗主要試劑 1X Low TE Buffer （10 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1 mM EDTA）；50 xTAE concentrate Solution buffer（生工生物工程（上海）有限公司，SD8101-500mL）；MinElute PCR Purification（KitQiagen，136270849）；Qubit?dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，Q32854）；HiSeq PE Cluster Kit v4（Illumina，PE-401-4001）；HiSeq SBS Kit v4（Illumina，FC-401-4003）。

1.4 實驗主要儀器設備 Qubit? 2.0 Fluorometer（Invitrogen，Q32866）；Magnetic Stand-96（Life Technologies，AM10027）；GeneAmp PCR System 9700（Life Technologies，4314878）；MicroCentrifuge（Eppendorf，5418）；cBot Clonal Amplification System（Illumina，SY-301-2002）；HiSeq 2500 Sequencing System（Illumina，SY-401-2501）。

1.5 實驗菌株 H37RV標準結核分枝桿菌菌株（ATCC：27294）由中國疾病預防控制中心四川結核病預防控制分中心提供，含量為1 mg/mL含1×106 cfu；耐異煙肼結核分枝桿菌菌株20130332（000962.3）由中國疾病預防控制中心四川結核病預防控制分中心提供，含量為1 mg/mL含1×106 cfu。

1.6 實驗場地 成都中醫藥大學基礎醫學院實驗室；四川省疾病控制預防中心實驗室，實驗室備案證書：川衛BSL-2-A備（2009）第0081-01號；上海伯豪生物科技有限公司。

1.7 實驗方法

1.7.1 動物造模及分組 SPF級昆明種小鼠120只，參照文獻[7]采用小鼠尾靜脈法建立耐異煙肼結核小鼠模型，選取80只SPF級昆明種小鼠，每只注射0.1 mL耐異煙肼菌懸液。將耐異煙肼結核小鼠隨機分為耐異煙肼結核模型組、異煙肼組、肺癆康組、聯合組，共四組，每組20只，再將其分別分籠編號。將H37RV標準菌菌懸液注入20只小鼠的尾靜脈，每只0.1 mL，編為標準菌株組，對其進行分籠編號。剩下20只小鼠，作為空白組。

1.7.2 藥物干預方法 造模1周后開始對6組小鼠進行藥物灌胃干預。用配制好的異煙肼液、肺癆康藥液、肺癆康聯合異煙肼藥液分別對異煙肼組、肺癆康組、聯合組的小鼠進行干預。模型組和空白組的小鼠用生理鹽水干預，按照20 g體重灌胃0.12 mL生理鹽水的標準，隨小鼠體重增減。以上五組小鼠均連續灌胃56 d。

1.7.3 標本的采集與保存 第57天脫頸椎處死小鼠，用75%酒精消毒小鼠體表5 min，無菌條件下解剖小鼠，完整取出雙肺，用生理鹽水沖洗，取小鼠肺門部位組織，約重0.1 g，放入無菌試管內，置冰箱保存。

1.7.4 基因組測序 隨機從5個實驗組中抽出1～2個小鼠肺組織樣本，并將這些樣本進行滅活，分離出結核分枝桿菌。采用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen，69506）設備，嚴格按照生產廠商提供的標準操作流程進行基因組DNA抽提及純化。純化后的DNA經Qubit? 2.0 Fluorometer和0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢，質檢合格的DNA進行后續的測序實驗。按照實驗說明書對基因組DNA進行片段化，末端修復、3末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構建。所建文庫使用Qubit? 2.0 Fluorometer檢測濃度，按照cBot User Guide所示相應流程，在Illummina HiSeq 2500測序儀配套的cBot上完成Cluster生成和第一向測序引物雜交。按照HiSeq 2500 User Guide準備測序試劑，將攜有cluster的flow cell上機測序。測序過程由Illumina提供的data collection software進行控制，并進行實時數據分析。

1.8 數據處理 測序得到的原始圖像文件，經過堿基識別及誤差過濾，得到可以用于分析的原始測序片段稱之為Reads。測序得到Raw Reads進行過濾，得到可用于數據分析的clean Reads。使用bwa軟件（version 0.7.8）對預處理后的reads進行Genome mapping（參考基因組版本為：肺結核桿菌（M.tuberculosis）H37RV標準菌（REF）），利用samtools軟件將原始文件轉換為bam文件，Picard軟件的Markduplicates工具用來標記可能的PCR重復，去掉可能的有PCR錯誤導入的假陽性突變，samtools的flagstat工具統計mapping信息。GATK的IndelRealigner 工具對bam文件中的存在INS/DEL的位點，或者已知的INS/DEL位點附近進行局部的多序列比對，減少因為插入缺失導致的reads邊緣假的SNP位點；InDel結果由GATK UnifiedGenotyper對多個樣品的bam文件同時處理，（保留Qual高于30的突變位點），Mapping生成的比對結果為BAM文件，結果由GATK Unified Genotyper對樣品bam文件同時處理，得到的vcf文件，snpEff軟件完成突變的注釋，通過Perl腳本處理得到最終的結果。同一個項目下的所有樣品方在同一個Excel表格下進行手工篩選比較。

2 結果

以ahpC基因為查找內容，手工篩選各excel表中snpEff軟件完成突變的注釋，模型組、肺癆康組、異煙肼組、聯合組分別與標準菌株組對比，發現

5個相同的能影響的堿基突變位點，分別為2721562、2723252、2723506、2729058、2729832。5個堿基突變位點其分別對應的堿基突變為C→G、T→G、T→C、A→C、G→C。其中肺癆康組與模型組對比，發現多出一個突變位點2729621，堿基突變為C→A。異煙肼組與模型組比較，發現多出一個突變位點2726141，堿基突變為C→T。發現2729621、2726141這兩個突變位點在聯合組中均能找到。與標準菌株作序列對比的4個實驗組的7個影響ahpC基因的堿基突變位點，與影響基因ahpC相對應的密碼子、氨基酸均未發生變化，見表1；這些突變位點的影響基因均不單一，2729058、2729621位點發生錯義突變，影響程度中等（MODERATE）。2729058密碼子cTg→cGg，氨基酸由亮氨酸變為精氨酸。2729621僅出現在肺癆康組、聯合組，密碼子Gcc→Tcc，引起氨基酸丙氨酸變為絲氨酸。2721562、2723252、2723506、2729832發生沉默突變，影響?。↙OW），不會影響蛋白質的功能和表達，其對應的氨基酸未被翻譯出來。2726141引起的變異位于基因間區，密碼子、氨基酸未發生改變，見表2。

3 討論

耐異煙肼結核是指經體外藥物敏感性試驗證實，對異煙肼耐藥的結核。異煙肼是治療結核最常用的一線藥物，其作用機制可能是抑制敏感細菌分枝菌酸的合成而破壞細胞壁結構的完整性。從1952年使用至今，已有63年的歷史?？赡苡捎诋悷熾麻L期、廣泛及不規范的使用，導致了異煙肼出現了全球性的耐藥。根據2007年在中國做的全國性調查，表明有16%新發結核病例和38.5%已經治療過的結核病例耐異煙肼[8]。耐異煙肼結核病一直被認為是發展成耐多藥結核的第一步[multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB：是指結核病患者感染的結核分枝桿菌經體外藥敏實驗證實至少同時對異煙肼（isoniazid，INH或H）和利福平（rifampicin，RFP或R）兩種以上一線抗結核藥物耐藥][9]。

目前已知的INH耐藥相關突變基因有katG、inhA、kasA、ahpC、oxyR、ndh。KatG基因和inhA基因的突變僅能解釋80%以上耐異煙肼菌株[10]，還有少部分的異煙肼耐藥與kasA、ahpC、oxyR、ndh等基因相關。文獻[11-12]提示，耐異煙肼結核桿菌ahpC的突變率為13.2%，ahpC突變引起ahpC蛋白的過量表達，降低過氧化物的濃度，從而阻抑了KatG介導的異煙肼活化，導致異煙肼耐藥[13-14]。已經發現的密碼子突變位點有-9、-46、-48、-49、

-50、-51、-52、-53、-54位（相對ahpC起始密碼子）等[15]。本次實驗研究顯示，影響ahpC基因的堿基突變位點有7個，其影響密碼子改變的位置均未在目前已經發現的突變位點上。ahpC基因對應的密碼子、氨基酸未發生突變。這7個位點的等位基因頻率均大于10%，可能是單核苷酸多態性（SNP）位點，可能與耐異煙肼結核分枝桿菌的易感染因素相關。肺癆康組、聯合組與模型組、異煙肼組相比較，多出突變位點2729621，其對應的密碼子Gcc→Tcc，氨基酸由丙氨酸變為絲氨酸。該位點可能是肺癆康干預過的小鼠與未使用肺癆康干預過的小鼠之間的個體差異的相關位點。肺癆康與修復ahpC基因突變相關的假設不成立，肺癆康抗結核的作用機制，需要參考與異煙肼耐藥相關的其他基因的文獻資料，做進一步研究討論。

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（收稿日期：2015-11-19） （本文編輯：蔡元元）