999感冒靈顆粒及組分對小鼠急性毒性和饑餓狀態下肝毒性影響的研究

郭秋平 徐婷婷 陳燕勤 甄瀅瀅 張躍飛 葉祖光 金若敏

[摘要]比較999感冒靈全方及不同組分對小鼠急性毒性的影響，比較在饑餓和正常飲食狀態下，感冒靈對小鼠肝毒性的影響。為臨床安全性再評價及合理的安全使用提供實驗依據。小鼠分別單次給予全方，化學藥組分及中藥組分，連續觀察14 d，測定全方組與化學藥組的LD50和中藥組最大耐受量；小鼠分為饑餓和飲食組，單次給予全方，觀察14 d，計算LD50；小鼠分為饑餓和飲食組，單次給感冒靈后6 h檢測血清生化指標和肝臟指數，計算TD50，觀察肝臟組織形態。全方組LD50為442 g·kg-1 ，化學藥組LD50為064 g·kg-1。中藥組最大耐受量接近2424 g·kg-1。全方組與化學藥組小鼠的毒性表現基本相似，體重、攝食量有一定程度的下降，部分存活動物有肝、心組織病變；全方組表現程度較輕，恢復較快；饑餓組小鼠LD50為256 g·kg-1，飲食組LD50為693 g·kg-1；饑餓組小鼠肝TD50為129 g·kg-1，飲食組小鼠肝TD50為630 g·kg-1。999感冒靈全方毒性較小，可能與中西藥組分配伍后有一定的減毒作用有關。正常飲食狀態和饑餓狀態相比，小鼠LD50及肝TD50數值明顯變大，毒性減小。從安全性角度提示在不饑餓狀態或餐后服用感冒靈更為安全，上述試驗為全方的臨床安全使用提供了實驗依據。

[關鍵詞]感冒靈顆粒；組分；急性毒性；肝毒性；饑餓；飲食

[Abstract]This paper was aimed to compare the acute toxicity of 999 Ganmaoling grain and its different ingredients， and investigate the influence of routine diet on the hepatic toxicity induced by Ganmaoling in mice， so as to provide experimental basis for the clinical safety evaluation Mice were given a single dose of Ganmaoling grain or its different ingredients respectively by gavage， and then observed for 14 days LD50 values of Ganmaoling grain or its chemical ingredient and the maximal tolerated dose of its herb ingredient were determined Mice were divided into starvation and diet group， a single dose of Ganmaoling grain was administered by gavage LD50 values were estimated after 14 day observation Mice were divided into starvation and diet group At the same time，control group was set up for each A single dose of Ganmaoling grain was given Serum biochemical indexes were detected， liver weight index was calculated and liver tissue morphological change was observed after 6 h LD50 values were 442， 064 g·kg-1 for Ganmaoling grain group and chemical ingredient group， respectively The maximal tolerated dose of the herb ingredient group was close to 2424 g·kg-1. The toxic symptom was basically similar in the Ganmaoling grain and the chemical ingredient group The body weight and food intake were decreased to a certain extent in both groups There were pathological changes of liver and heart tissue in some of the surviving animals The animals in the Ganmaoling grain group exhibited a lighter toxicity and recovered faster than that in the chemical ingredient group LD50 values of Ganmaoling grain were 256， 693 g·kg-1 for starvation and diet group respectively TD50 values were 129， 631 g·kg-1 for starvation and diet group respectively The toxicity of 999 Ganmaoling was less， which may be related to the reduction of toxicity after the combination of herb and chemical ingredients Compared with starvation group， the values of LD50 and TD50 of diet group was significantly increased， and toxicity was decreased From the point of view of safety， it is safer to use Ganmaoling in the absence of hunger or after meal The above tests provide experimental basis for the clinical safety use of Ganmaoling

[Key words]Ganmaoling grain； ingredient； acute toxicity； liver toxicity； starvation； diet

doi：10.4268/cjcmm20160806

999感冒靈顆粒是用于感冒引起的頭痛、發熱、鼻塞、流涕、咽痛等癥狀的中西復方制劑，由化學藥咖啡因、撲爾敏、對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）及中藥三丫苦、金盞銀盤、崗梅等組成。本研究分別采用感冒靈全方、化學藥組、中藥組進行小鼠急性毒性比較試驗，以期從毒理學角度來評價感冒靈全方中化學藥和中藥復方配伍的合理性。此外，該藥的禁忌癥為嚴重肝腎功能不全者禁用，本課題組前期實驗顯示感冒靈引起的毒性癥狀與APAP相似。已有文獻報道[13]APAP在過量或饑餓狀態等情況下，可引起嚴重的肝毒性，甚至死亡，應引起警惕。因此，本研究針對這一不良反應，考察在饑餓或正常飲食狀態下，感冒靈對小鼠的急性毒性（LD50）、肝毒性TD50的比較，以期為含有對乙酰氨基酚的復方制劑臨床安全性用藥和風險控制措施提供實驗依據。

1材料

感冒靈化學藥組（以下簡稱化學藥組，批號20121201），感冒靈中藥組（浸膏粉，以下簡稱中藥組，批號2012121901），感冒靈全方組（不含賦形劑，以下簡稱全方組，化學藥組與中藥組按處方比例混合），感冒靈（批號2013030601），上述藥物均由華潤三九醫藥股份有限公司提供。臨用前用05%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）配制到所需濃度。

羧甲基纖維素鈉（CMCNa，分析純，批號20120817，天津市大茂化學試劑廠），以除菌水配制成05% CMCNa使用。ALT檢測試劑盒（R1批號F449，R2批號F444），AST檢測試劑盒（R1批號D449，R2批號L341）均購自上海日和貿易有限公司。

不同組分小鼠急性毒性比較試驗：ICR小鼠，雌雄各半，實驗時雄性體重（20±2） g，雌性（20±3） g，購自湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，SPF級，合格證號43034701838。廣州醫藥研究總院藥物非臨床評價研究中心SPF級動物房飼養。實驗環境：光照12 h明/12 h暗，最小換氣次數15次/h，室溫20～24 ℃，濕度40%～70%；飼養條件：大小鼠的飼料購自上海斯萊克實驗動物有限公司，衛生標準符合GB1492422001，營養標準符合GB1492432010。動物飲用水為過濾除菌水， 動物飲用水符合國家飲用水標準。

饑餓狀態下的毒性試驗：ICR小鼠，雌雄各半，購自中國科學院上海實驗動物中心，合格證號SCXK（滬）20120002，上海中醫藥大學實驗動物中心清潔級飼養。實驗環境同上。

OLYMPUS BX 41生物熒光顯微鏡，OLYMPUS DP71圖像采集頭（日本 OLYMPUS公司）；病理圖像分析軟件IPP 60（美國Mediacybernetics公司）；7080型全自動生化分析儀（日本日立貿易有限公司）；ME204E電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

2方法

21不同組分小鼠急性毒性比較[45]

211全方、化學藥組分組小鼠急性毒性（LD50）試驗

首先進行預試摸索其致死和非致死劑量后，然后開始進行正式的急性毒性試驗。全方、化學藥組分組各取小鼠60只，按體重、性別均衡隨機分成6個劑量組，組間距均為085，每組10只，雌雄各半。給藥前1 d動物禁食14～16 h，以20 mL·kg-1單次灌胃給藥，給藥后觀察6 h，以后每天觀察1～2次，持續觀察2周。

212中藥組對小鼠最大耐受量（MTD）試驗

經預試驗發現中藥組口服給予最大給藥劑量和給藥容積，小鼠仍沒有死亡，故進行最大耐受量試驗。取小鼠40只，按體重、性別均衡隨機分成2組，分別為陰性對照組和中藥給藥組，每組20只，雌雄各半。給藥前1 d動物禁食14～16 h，中藥組單次灌胃中藥2424 g·kg-1，陰性對照組（以下簡稱對照組）同法給予等容量（40 mL·kg-1）05% CMCNa。給藥后觀察6 h，以后每天觀察1～2次，持續觀察2周。

郭秋平等：999感冒靈顆粒及組分對小鼠急性毒性和饑餓狀態下肝毒性影響的研究

213檢測指標

一般觀察：動物體重變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等。記錄動物的死亡情況，于給藥后第1，3，5，7，14天測定動物體重及攝食量。

病理學檢查：中毒死亡或瀕死動物及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結束后脫臼處死，進行大體解剖，大體檢查臟器包括氣管、食道、皮膚、胸腺、腎上腺、胰腺、胃、腸（十二指腸、空腸、回腸、結腸、直腸）、心、肺、肝、脾、腎、腦、淋巴結、膀胱、前列腺、睪丸（連附睪）、子宮、卵巢。當發現器官出現體積、顏色、質地等改變時，則對改變的器官用10%中性福爾馬林固定，經脫水、常規石蠟包埋制片，HE染色，光鏡下進行組織病理學檢查。

病理診斷標準如下。肝臟：①正常肝細胞，為（-）；②肝細胞輕度水腫，為（+）；③肝細胞廣泛性水腫，為（）；④肝細胞壞死，為（）。心臟：①正常心肌組織，為（-）；②心肌偶見點灶性壞死，為（+）；③心肌多處點灶性壞死，為（）；④心肌斷裂，排列紊亂，為（）。胃腸：①正常胃腸組織，為（-）；②胃腸黏膜層少量細胞脫落，為（+）；③胃腸黏膜層大量細胞脫落，為（）；④胃腸黏膜壞死，為（）。

22饑餓或飲食情況下感冒靈對小鼠LD50的比較[45]

取ICR小鼠，隨機分為饑餓組、正常飲食組（以下簡稱飲食組），雌雄各半。饑餓組給藥前夜禁食16 h，給藥后禁食6 h，然后給予食物；飲食組給藥前后均給予食物，2組分別設不同劑量的處理組，每小組10只動物。小鼠以20 mL·kg-1單次灌胃給藥后連續觀察14 d，并記錄各劑量組死亡動物數及相關指標。中毒死亡或瀕死動物及時進行解剖，存活動物在試驗結束后脫臼處死，解剖取肝臟，于10%福爾馬林溶液中固定，制備石蠟切片HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。計算2組的LD50及95%可信限及對肝組織病理變化進行比較。

23饑餓或飲食情況下感冒靈對小鼠肝毒性TD50的比較研究[45]

取ICR小鼠，同上隨機分為饑餓組、飲食組。各組再分設不同劑量處理組，每組10只，雌雄各半，小鼠以20 mL·kg-1單次灌胃6 h后摘眼球取血，檢測指標：血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）；稱肝臟質量并計算肝臟指數，肝臟經HE染色后觀察其組織形態學變化，病理診斷標準同上。綜合試驗結果，以ALT，AST顯著升高或病理損傷三者之一發生變化判定為肝臟損傷。根據小鼠肝臟損傷的動物數，計算2組肝毒性的TD50及95%可信限，并進行比較。

24統計學處理

實驗結果中計量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（OneWay ANOVA）。組間兩兩比較方差齊性時用LSD方法分析，方差不齊時用Dunnett′s 3方法分析。采用SPSS 150統計學軟件進行統計分析。

LD50，TD50計算采用Bliss法。等級資料采用Ridit分析處理。P<005或P<001認為有統計學意義。

3結果

31全方和不同組分小鼠急性毒性比較

311小鼠死亡情況

化學藥組、全方組動物死亡數量隨劑量升高而增多，與劑量呈正相關，經計算，化學藥組對小鼠的半數致死劑量LD50為064 g·kg-1，95%可信限為053～078 g·kg-1。全方組對小鼠的半數致死劑量LD50為442 g·kg-1，95%可信限為386～505 g·kg-1。雄性小鼠對化學藥組毒性的敏感性大于雌性小鼠。動物死亡分布見表1。在中藥組的最大耐受量試驗中，中藥組1/20例動物死亡，該組對小鼠的最大耐受量略低于24240 g·kg-1。

312小鼠一般狀態

化學藥組、全方組動物表現基本一致，部分動物在給藥后30～60 min開始陸續出現閉眼、呼吸加快、抽搐、豎毛、眼球發白、眼周有分泌物、步履不穩、活動減少、翻正反射消失等癥狀的一種癥狀或多種癥狀，6 h內動物多出現抽搐而死亡。當天給藥后4～6 h，各組均有部分動物開始恢復或恢復正常。動物反應的嚴重程度及反應動物數量與藥物的劑量呈正相關。但全方組較化學藥組開始恢復或恢復到正常的時間提早1 d。

中藥組動物在給藥后60 min內陸續開始出現活動減少、稀便、閉眼、豎毛、俯臥不動、翻正反射消失等癥狀中的一種或多種癥狀；有1只動物呼吸

加快，4 h后恢復；有1只動物在4～6 h抽搐而死亡。存活動物于第2天已恢復正常。

313對小鼠攝食量、體重的影響

化學藥組、全方組中除最低劑量組外，其他各劑量組動物在給藥當天攝食量均明顯減少。體重有所減輕，第5天開始回升，并保持增長至試驗結束，有量效關系。

在上述全方組和化學藥組的急性毒性（LD50）試驗中，分別選擇全方組的420 g·kg-1劑量（該劑量接近于全方組中化學藥組的劑量073 g·kg-1）以及化學藥組069 g·kg-1，比較這2個劑量組動物的攝食量、體重的變化情況。可見在相近劑量下全方組動物攝食量和體重恢復較快，見表2，3。

314對小鼠組織病理學的影響

3141化學藥組動物主要病變在胃腸道、肝臟、心臟；腎組織結構未見明顯異常。

死亡動物解剖大體觀察可見個別動物胃腸黏膜潮紅；組織學檢查可見個別動物胃腸黏膜層少量細胞脫落、肝臟廣泛性肝細胞水腫及肝瘀血。

末期存活動物解剖大體觀察可見較多動物肝臟表面出現大小不等白色斑塊或斑點；組織學檢查可見部分動物肝臟局部組織壞死及嗜堿性物質沉積、肝瘀血。心肌多處點灶性壞死及嗜堿性物質沉積。

3142全方組動物主要病變在胃腸道、肝臟、心臟；腎組織結構未見明顯異常。

死亡動物解剖大體觀察可見少量動物胃脹氣及胃腸黏膜層潮紅，其他臟器未見明顯異常；組織學檢查可見個別動物胃腸黏膜層少量上皮細胞脫落；肝臟廣泛性肝細胞水腫及肝瘀血。

末期存活動物解剖大體觀察可見大量動物肝臟表面出現大小不等的白色斑點或斑塊；組織學檢查可見個別動物肝臟局灶性壞死、嗜堿性物質沉積、肝細胞廣泛性輕度水腫變化及肝瘀血，心肌點灶性壞死伴嗜堿性物質沉積。

根據死亡動物的組織病理學的檢查結果，全方組與化學藥組相比，存活動物均未見胃腸道組織嚴重病變，但化學藥組出現胃腸道病變的動物壞死病變范圍稍廣、程度較嚴重；化學藥組肝臟組織出現廣泛性肝細胞水腫性變化的動物數及病變程度均稍高于全方組。化學藥組出現心肌病變范圍較全方組廣泛、程度較嚴重，見表6。

3143中藥組有1例雄性動物在給藥后6 h內死亡，解剖大體觀察見結腸稍有脹氣，其他主要臟器未見異常病變。末期存活動物解剖大體觀察，各主要組織臟器未見異常。

3144全方與化學藥組的比較全方LD50劑量為442 g·kg-1，其中含化學藥量為073 g·kg-1，與單獨化學藥組LD50劑量064 g·kg-1比，全方中的化學藥量升高了009 g·kg-1，約提高了14%，見表7。

在毒理學特征表現方面：全方組和化學藥組基本一致，如對不同性別的毒性強度比較，雄性動物對毒性的敏感性均大于雌性；但若以化學藥與全方中含化學藥量相近的2個劑量組比較，單純化學藥組的毒性反應程度要比全方組為大，例如，化學藥組動物的攝食量及體重下降的幅度均大于全方組，恢復也較慢；存活動物的組織病理學檢查結果顯示，化學藥組動物出現肝臟、心肌病變的動物數較之全方組為多，且組織壞死病變范圍較為廣泛、程度也較嚴重。

32饑餓或飲食狀態下感冒靈對小鼠LD50的比較研究

321饑餓組

3211一般觀察各組有部分動物在給藥后1 h內陸續出現豎毛、呼吸加快、步履不穩、活動減少、翻正反射消失等一種癥狀或多種癥狀，有一定的量效關系。LD50為2556 g·kg-1，95%可信限為2094～2947 g·kg-1。

3212對動物肝組織病理學的影響觀察期間，動物死亡時經解剖發現肝臟腫脹變大，大部分或全部為黑紅色斑塊。部分存活動物經解剖發現肝臟肝包膜下肉芽腫，可見大量多核巨細胞。

322飲食組

3221一般觀察除最低劑量組外，其他組部分動物在給藥后2 h內陸續出現癥狀同饑餓組相似，有一定的量效關系。LD50為6933 g·kg-1，95%可信限為6325～7689 g·kg-1，LD50是饑餓狀態下的27倍。

3222對動物肝組織病理學的影響觀察期間，死亡動物解剖發現肝臟腫脹變大，大部分或全部為黑紅色斑塊。部分存活動物經解剖發現肝細胞出現水腫、小灶性壞死、肝包膜下出現肉芽腫、可見大量多核巨細胞等。

33饑餓或飲食狀態下感冒靈對小鼠TD50的比較研究

331饑餓組

3311對血清生化及臟器指數的影響與對照組比，1416 g·kg-1組小鼠血清ALT，AST，肝臟指數顯著升高（P<005），有1只動物死亡，見表8。

3312對肝組織病理學的影響對照組，0595 g·kg-1，0798 g·kg-1組各有1只動物肝組織偶見一處肝細胞點狀壞死，1062 g·kg-1組有1只動物出現輕微肝損傷。1416 g·kg-1組有1只動物出現輕微肝損傷，5只動物出現嚴重肝損傷，肝組織多發或大片出血壞死；與對照組比，有顯著差異（P<001）。1416 g·kg-1組動物有1只死亡，解剖發現肝臟大部分為黑紅色斑塊，臟器腫脹變大。

332飲食組

3321對血清生化及臟器指數的影響與對照組比，3540 g·kg-1組小鼠血清ALT及4720 g·kg-1組小鼠血清ALT，AST顯著升高（P<001），但升高幅度不大；肝臟指數均無明顯變化，見表9。

3322對肝組織病理學的影響對照組，2001 g·kg-1，2657 g·kg-1組有1只動物肝組織偶見一處肝細胞點狀壞死，3540 g·kg-1組、4720 g·kg-1組分別有1只和2只動物出現輕微肝組織出血壞死。與對照組比，均無顯著性差異。

3323肝臟毒性比較TD50值比較：饑餓組為1292 g·kg-1，95%可信限為1114～1802 g·kg-1，飲食組為6306 g·kg-1，95%可信限為4657～0428 g·kg-1，飲食組TD50是饑餓組的49倍，表明毒性小。

將饑餓組1416 g·kg-1與飲食組1492 g·kg-1 2個相近劑量組的結果比較，饑餓組血清ALT，AST及肝組織病變例數顯著升高（P<005），見表10。

4討論

國家食品藥品監督管理總局自2007年來積極采取了多項措施，鼓勵或要求對上市后藥品開展再評價工作，特別是國務院頒發了《國家藥品安全十二五規劃》，著重強調了藥物再評價[6]。王駿等分析認為，目前復方中藥物配伍多以藥效的協同增效作用為依托[7]。藥物不良反應通常與藥物的使用劑量相關，將具有協同作用的藥物進行組合，進而達到減小藥物使用劑量的目的，如市場常見的感冒靈顆粒、維C銀翹片等，由于藥效的協同作用從而減少對乙酰氨基酚的用量，減少了不良反應的發生，提高了用藥安全性。荊恒攀等提出以克服藥品不良反應為目的開發新復方制劑的思路[8]，本文從減毒配伍角度評價感冒靈復方制劑中化學藥和中藥配伍的合理性。對乙酰氨基酚（APAP）是目前應用最廣泛的非處方類解熱鎮痛藥物之一，999感冒靈則是含有APAP的中西藥復方制劑，其中APAP日服量為600 mg，遠低于常用化學藥感冒藥中APAP用量。一般而言，治療劑量的APAP是比較安全的，但超劑量使用時，會引起一些不良反應，特別是肝毒性，APAP在美國和歐洲等國家是引起急性肝功能衰竭的常見原因[9]。

在前期試驗中，作者發現大鼠對對乙酰氨基酚的毒性不甚敏感，而小鼠卻對對乙酰氨基酚的肝毒性較為敏感，故本實驗選擇小鼠進行試驗，小鼠LD50實驗結果提示999感冒靈顆粒中西藥組分配伍后有一定的減毒趨勢。分析全方和化學藥組出現毒性的現象，可能與化學藥對乙酰氨基酚及咖啡因的作用與不良反應有關。

文獻報道[912]服用大劑量或長期使用APAP，在體內生成毒物較大的自由基代謝產物N乙酰對苯醌亞胺（NAPQI） ，而體內谷胱甘肽（GSH），尤其是肝細胞內的谷胱甘肽能參與其生物轉化，從而把機體內有害的N乙酰對苯醌亞胺（NAPQI）轉化為無害的物質，排出體外。一些因素可以通過影響體內GSH水平而影響APAP肝臟毒性，例如N乙酰半胱氨酸可通過提高胞內GSH水平，有效減輕過量APAP引起的肝臟損傷[13]；飲食可明顯使內源性GSH濃度增加[10]。本研究顯示，在急性毒性試驗中，飲食組小鼠LD50約為饑餓組的3倍；在肝毒性試驗中，飲食組肝毒性TD50約為饑餓組的5倍，表明饑餓狀態下會明顯增加動物的死亡率和增加主要毒性靶器官的肝損傷；推測飲食可使內源性GSH濃度增加，從而減輕了高劑量感冒靈中APAP引起的肝臟損傷。該結果與文獻報道[13]APAP在過量或饑餓狀態等情況下，可引起嚴重的肝毒性，甚至死亡是一致的。

本文補充了從復方制劑的毒理學——減毒角度考慮藥物配伍研究，表明999感冒靈全方毒性較小，可能與中西藥組分配伍后有一定的減毒作用有關。飲食組與饑餓組的小鼠LD50與肝TD50結果提示從安全性角度出發，在不饑餓狀態或餐后服用感冒靈更為安全。本研究為含有對乙酰氨基酚等化學藥的中西藥復方制劑安全性再評價提供了一種研究方法，也為含有對乙酰氨基酚的復方制劑臨床安全性用藥和為風險控制措施提供了實驗依據。

[致謝]雷夏凌、楊威參加了此項工作。

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[責任編輯馬超一]