大黃酸神闕穴給藥經(jīng)皮滲透性的影響因素研究與初步機(jī)制探討

封玲 丁美紅 沈勤 孫秋華 石森林

[摘要]采用VC擴(kuò)散池，分別以新鮮的離體大鼠、家兔、小型豬的神闕穴及非穴位區(qū)皮膚為滲透屏障，以20%乙醇的生理鹽水為接收液，進(jìn)行滲透試驗(yàn)，HPLC測(cè)定大黃酸含量，以累積透過(guò)量、穩(wěn)態(tài)透皮速率為指標(biāo)；同時(shí)采用激光共聚焦顯微鏡可視化觀察大黃酸經(jīng)皮吸收差異，考察大黃酸經(jīng)神闕穴和非穴位以及不同種屬動(dòng)物神闕穴皮膚的滲透特性。結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴皮膚的累積滲透量為（10263±960） μg·cm-2，穩(wěn)態(tài)透皮速率為4307 μg·cm-2·h-1，均高于經(jīng)非穴位區(qū)皮膚；大黃酸經(jīng)不同種屬動(dòng)物神闕穴給藥的累積滲透量和穩(wěn)態(tài)透皮速率為大鼠>家兔>小型豬，兩兩比較，存在顯著性差異；熒光吸收?qǐng)D顯示皮膚中的藥物含量為神闕穴>非穴位，大鼠>家兔>小型豬。研究結(jié)果表明，大黃酸經(jīng)皮滲透存在種屬、穴位差異，經(jīng)神闕穴位皮膚給藥的透過(guò)量及速率顯著高于非穴位皮膚，大黃酸神闕穴給藥的初步機(jī)制可能是神闕穴為藥物傳遞提供通道、載體，可視化驗(yàn)證了臨床貼敷神闕穴治療疾病具有特異性和優(yōu)越性。

[關(guān)鍵詞]大黃酸；神闕穴；種屬；透皮特性

[Abstract]To study rhein′s permeative properties of acupoint and nonacupoint and different species′ transdermal administration in vitro Cumulative permeation amount and steadystate infiltration rate were taken as evaluative indexes to assess the permeability difference The ValiaChien diffusion cell method was used to conduct the permeability test， with fresh acupoint and nonacupoint skin of rat， rabbit and swine in vitro as permeation barriers， and blank 20% EtOH saline as absorption liquid HPLC was used to determine the rhein The absorption difference was observed by confocal laser scanning microscopy The 24hour cumulative permeation amount through acupoint skin in rats was （10263±960） μg·cm-2， the steadystate infiltration rate was 4307 μg·cm-2·h-1， both were higher than that through nonacupoint skin The thickness of acupoint skin in rat was thinner than that in rabbit and swine The cumulative permeation amount and steadystate infiltration rate of rhein in acupoint of rat were signally higher than those in rabbit and swine The absorption difference can be clearly observed through an accumulation of fluorescence In conclusion， species and acupoint all affect the permeability of rhein in vitro The permeation amount and rate of rhein on Shenque acupoint were better than that on nonacupoint skin， which could verify that treatment through Shenque acupoint is superior to that through nonacupoint The preliminary mechanism may be the drug delivery through Shenque acupoint as a channel and carrier， which is a visual verification the specificity and superiority of clinical application through Shenque acupoint in treating diseases

[Key words]rhein； Shenque acupoint； species； permeability

doi：10.4268/cjcmm20160830

穴位經(jīng)皮給藥是以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，將經(jīng)絡(luò)腧穴與經(jīng)皮給藥相結(jié)合，通過(guò)體表穴位吸收藥物，再通過(guò)經(jīng)絡(luò)運(yùn)行到達(dá)臟腑，在藥物和經(jīng)絡(luò)雙重作用下達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體功能和治療疾病的目的，是中醫(yī)方藥與針灸經(jīng)絡(luò)巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，優(yōu)于一般的經(jīng)皮給藥途徑。研究表明，以穴位為載體的給藥方式可將藥物直接作用于相關(guān)臟腑，而口服、注射等給藥方式需將藥物吸收進(jìn)入體循環(huán)，在全身廣泛分布，因此穴位經(jīng)皮給藥具有減少藥物劑量、提高療效的優(yōu)點(diǎn)[1]。

隨著穴位經(jīng)皮給藥研究的不斷深入，以及經(jīng)絡(luò)穴位給藥系統(tǒng)在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用逐漸廣泛，動(dòng)物模型的選擇越來(lái)越受到重視。目前國(guó)內(nèi)外大多采用小鼠、大鼠、裸鼠、兔、豬、犬等動(dòng)物進(jìn)行皮膚給藥及針灸穴位的研究，但研究較為獨(dú)立[24]，少見(jiàn)進(jìn)行不同種屬動(dòng)物模型間的經(jīng)穴位給藥的比較研究。

神闕穴屬互為表里的任脈、督脈，與人體諸經(jīng)百脈相通；位于機(jī)體臍部，臍為胚胎發(fā)育的最后閉合處，表皮角質(zhì)層薄，皮下無(wú)脂肪組織，與筋膜、腹膜相連，滲透力強(qiáng)。臨床上常用藥物貼敷神闕穴用于治療腹瀉、便秘、痛經(jīng)等癥，說(shuō)明神闕穴在治療腹部區(qū)域疾病方面有一定的特異性[5]。參黃方是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)徐志瑛根據(jù)臨證經(jīng)驗(yàn)加減大承氣湯而來(lái)，敷貼患者神闕穴用于治療術(shù)后胃腸功能不全，已在全國(guó)多家醫(yī)院開(kāi)展，具有確切的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)，療效顯著[68]。本文前期主要從臨床療效和藥效指標(biāo)來(lái)闡明該方的作用機(jī)制[912]，對(duì)方中藥物在給藥部位的經(jīng)皮吸收特性尚未深入研究。

本文以方中君藥大黃的有效成分大黃酸經(jīng)皮透過(guò)量和滲透系數(shù)等為指標(biāo)，以非穴位區(qū)皮膚為對(duì)照，采用大鼠、家兔、小型豬3種動(dòng)物神闕穴皮膚作為滲透屏障，開(kāi)展經(jīng)皮吸收特性研究，以期揭示參黃方神闕穴給藥的科學(xué)內(nèi)涵，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

大黃酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110757200206，供含量測(cè)定用）；大黃酸原料藥（南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)2015021104）；甲醇、磷酸等均為色譜純；氯化鈉、乙醇等均為分析純。

TK6H1型VC雙室透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；BT1002J蠕動(dòng)泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Agilent 1200（美國(guó)Agilent公司）；MilliQ型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；1/10萬(wàn)XS105電子天平（梅特勒托利多）；WH861 渦旋混合器（太倉(cāng)市科教儀器廠）； KQ300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；數(shù)顯千分測(cè)厚儀（深圳市順豐金電子有限公司）；Leica CM1950冰凍切片機(jī)（德國(guó) Leica公司）；Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

家兔，雄性，體重（25±02） kg，合格證號(hào)SCXK（蘇）20150003；小型豬，雄性，體重（30±2） kg，合格證號(hào)SCXK（滬）20140013，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SD大鼠，雄性，SPF級(jí)（200±20） g，合格證號(hào)SCXK（滬）20150016，上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2方法與結(jié)果

21大黃酸含量測(cè)定方法的建立

211對(duì)照品溶液的配制取大黃酸對(duì)照品14 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含大黃酸0028 6 mg）。

212供試品溶液的制備取大黃原料藥約2 mg，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

213色譜條件色譜柱為Kromasil C18（46 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇01%磷酸（80∶20），流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

214專(zhuān)屬性試驗(yàn)取空白皮膚溶液、對(duì)照品溶液、原料藥溶液及藥物作用于皮膚后的透皮接收液，分別進(jìn) HPLC，結(jié)果見(jiàn)圖1。可以看出大黃酸原料藥中其他雜質(zhì)成分、空白透皮液等對(duì)大黃酸的測(cè)定沒(méi)有影響，透皮接收液中大黃酸的出峰時(shí)間與對(duì)照品溶液基本一致。

215標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取大黃酸對(duì)照品溶液（0028 6 g·L-1）1，5，10，15，20 μL，分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A= 3 8009C-3132 1（r=1000 0），結(jié)果表明，大黃酸在286～572 ng具有良好的線性關(guān)系。

216精密度試驗(yàn)精密量取上述大黃酸對(duì)照品溶液，甲醇稀釋一定倍數(shù)，配制成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液（001，002，078 g·L-1），連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定大黃酸峰面積，結(jié)果其RSD分別為016%，010%，0030%，表明精密度符合要求。

A空白皮膚樣品溶液；B對(duì)照品溶液；C原料藥溶液；D體外透皮接收液。

圖1大黃酸在不同樣品中的HPLC圖

Fig1HPLC chromatograms of rhein in different samples

217穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液于日內(nèi)0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定大黃酸峰面積。結(jié)果其峰面積RSD為031%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

218重復(fù)性試驗(yàn)分別精確稱(chēng)取同一批大黃酸原料藥6份，按供試品制備項(xiàng)下制備，依法操作。結(jié)果6份原料中大黃酸含量的RSD為19%，表明該方法重復(fù)性良好。

219加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的大黃酸原料藥9份，精密稱(chēng)定，分別加入一定量的大黃酸對(duì)照品，按供試品制備項(xiàng)下制備成加樣供試品溶液，再按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。大黃酸的加樣回收率在9589%～1050%，平均回收率為1000%，RSD為24%，符合要求。

22離體滲透試驗(yàn)

221神闕穴和非神闕穴的定位[13]選取大鼠、家兔、小型豬肚臍中央的神闕穴，穴位的定位參考“常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”定位標(biāo)準(zhǔn)而定。大鼠、家兔非神闕穴的定位：在距離神闕穴區(qū)域約1 cm 處的腹部、側(cè)部、背部皮膚，對(duì)照“穴位圖譜”盡量避開(kāi)其他穴位。

222離體皮膚的制備將SD大鼠、家兔、小型豬用戊巴比妥麻醉，電動(dòng)脫毛器小心剃除皮膚的被毛（不得有劃痕），取SD大鼠神闕穴區(qū)和腹部、側(cè)部、背部非穴位區(qū)皮膚，以及家兔、小型豬神闕穴區(qū)皮膚，各剪成直徑為25 mm的皮片。把皮膚平鋪在干凈的玻璃板上，讓角質(zhì)層向下，用小刀片或其他鈍器沾生理鹽水剔除皮下脂肪，然后用生理鹽水反復(fù)漂洗干凈，濾紙吸干，置于鋁箔紙上，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫趯?shí)驗(yàn)前一天取出，自然解凍，使用前用生理鹽水反復(fù)淋洗至澄清。

223皮膚厚度測(cè)定分別取大鼠、家兔、小型豬的神闕穴位皮膚及大鼠腹部、側(cè)部、背部非穴位皮膚，用千分測(cè)厚規(guī)測(cè)量皮膚的厚度，結(jié)果見(jiàn)表2。大鼠神闕穴區(qū)皮膚的厚度薄于非穴位區(qū)，3種動(dòng)物的神闕穴區(qū)皮膚厚度大小順序?yàn)樾⌒拓i>家兔>大鼠。將其進(jìn)行兩兩比較，可以看出大鼠腹部非穴位皮膚與神闕穴區(qū)域在皮膚厚度上無(wú)顯著差異，其余各組均有極顯著差異（P<001）。

224滲透試驗(yàn)采用TK6H1型VC雙室透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀，擴(kuò)散池容積5 mL，內(nèi)徑12 cm，有效滲透面積A為113 cm2。取離體低溫保存的皮膚固定于擴(kuò)散池的結(jié)合部，皮膚的角質(zhì)層面向供給池，池中加入一定質(zhì)量濃度的大黃酸溶液；接受池內(nèi)加入接受液（20%乙醇的生理鹽水）。擴(kuò)散池水浴外套與蠕動(dòng)泵和恒溫加熱磁力攪拌器相接，保持恒溫恒速攪拌，水浴溫度（32±05） ℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1。于05，1，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)間點(diǎn)取樣，每次取出全部接受介質(zhì)，然后用等溫度的含20%乙醇的生理鹽水補(bǔ)充至原體積量。所取樣品經(jīng)045 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定（若樣品濃度低于大黃酸含量測(cè)定的線性范圍，蒸干后用甲醇稀釋?zhuān)?jì)算藥物的累積透過(guò)量及穩(wěn)態(tài)透過(guò)速率。

225數(shù)據(jù)處理按下式計(jì)算校正藥物濃度（Cn校）、單位面積累積滲透量（Qn），穩(wěn)態(tài)透過(guò)速率（Js）、滲透系數(shù)（P）。以不同時(shí)間的Q對(duì)時(shí)間t做圖，該圖的直線部分斜率即為Js。

Cn校=Cn+∑n-1i=1Ci

Qn=Cn校·V/A

P=Js/C0

式中，Cn校為t時(shí)間藥物的校正質(zhì)量濃度（mg·L-1），Ci為t時(shí)間前藥物的測(cè)定質(zhì)量濃度（mg·L-1），Cn為t時(shí)間藥物的測(cè)定質(zhì)量濃度（mg·L-1），V 為接受池中接受液體積（mL），A為擴(kuò)散池面積（cm2），C0為供給池中供試藥物質(zhì)量濃度（mg·L-1）。

23大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴與非穴位皮膚滲透性研究

231大黃酸經(jīng)離體大鼠神闕穴與非穴位皮膚的滲透曲線取離體大鼠神闕穴、腹部非穴位、側(cè)部非穴位、背部非穴位皮膚，固定在供給池與接受池之間，供給池中加入大黃酸過(guò)飽和溶液，按照224項(xiàng)中方法操作；根據(jù)225項(xiàng)中公式計(jì)算累積滲透量，以累積滲透量對(duì)時(shí)間t作圖，得到相應(yīng)的滲透曲線，見(jiàn)圖2，在24 h內(nèi)，大黃酸經(jīng)神闕穴皮膚的累積滲透量Qn為（102631±9602） μg·cm-2，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神闕穴區(qū)累積滲透量均高于非神闕穴區(qū)皮膚。

232大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴與非穴位皮膚的相關(guān)滲透參數(shù)按照225項(xiàng)中公式計(jì)算大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴與非穴位皮膚的穩(wěn)態(tài)透過(guò)速率（Js） 、相關(guān)系數(shù)r及滲透系數(shù)（P），結(jié)果見(jiàn)表3。大黃酸經(jīng)4個(gè)區(qū)域離體皮膚的的穩(wěn)態(tài)透皮速率與滲透系數(shù)的大小順序?yàn)樯耜I穴>腹部非穴位>側(cè)部非穴位>背部非穴位，將神闕穴與非穴位的相關(guān)滲透參數(shù)進(jìn)行兩兩比較，t檢驗(yàn)結(jié)果表明大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴與經(jīng)腹部、側(cè)部、背部非穴位皮膚的累積滲透量、穩(wěn)態(tài)透皮速率與滲透系數(shù)之間均存在極顯著差異（P<001），經(jīng)神闕穴的滲透系數(shù)為非穴位的13～25倍，以上結(jié)果表明藥物經(jīng)神闕穴給藥滲透得更快更多，神闕穴位皮膚更有助于藥物的滲透吸收，間接驗(yàn)證了參黃方臨床貼敷神闕穴的科學(xué)性。

24大黃酸經(jīng)不同動(dòng)物神闕穴區(qū)皮膚滲透性

241大黃酸經(jīng)不同動(dòng)物神闕穴區(qū)皮膚的滲透曲線分別取大鼠、家兔、小型豬的神闕穴區(qū)皮膚，固定在供給池與接受池之間，供給池中加入大黃酸過(guò)飽和溶液，按照224項(xiàng)中方法操作；根據(jù)225項(xiàng)中公式計(jì)算累積滲透量，以累積滲透量對(duì)時(shí)間t作圖，得到相應(yīng)的滲透曲線，見(jiàn)圖3，在24 h內(nèi)，大黃酸經(jīng)大鼠神闕穴皮膚的累積滲透量Qn高于家兔和小型豬，是家兔的6倍，小型豬的46倍，不同種屬間的經(jīng)皮吸收差異顯著。

242大黃酸經(jīng)不同動(dòng)物神闕穴區(qū)皮膚的相關(guān)滲透參數(shù)按照225項(xiàng)中公式計(jì)算大黃酸經(jīng)大鼠、家兔、小型豬神闕穴區(qū)皮膚的穩(wěn)態(tài)透過(guò)速率（Js）、相關(guān)系數(shù)r及滲透系數(shù)（P），結(jié)果見(jiàn)表4。大黃酸經(jīng)3種動(dòng)物神闕穴區(qū)皮膚的累積滲透量、穩(wěn)態(tài)透皮速率與滲透系數(shù)的大小順序?yàn)榇笫?家兔>小型豬。將3種動(dòng)物的相關(guān)滲透參數(shù)進(jìn)行兩兩比較，t檢驗(yàn)結(jié)果表明各組之間均存在極顯著差異（P<001），表明同一藥物在不同種屬動(dòng)物同一穴位經(jīng)皮給藥，滲透

25大黃酸在不同種屬動(dòng)物神闕穴區(qū)皮膚組織中的分布

為進(jìn)一步考察神闕穴與非穴位區(qū)皮膚給藥后，藥物在皮膚的分布情況，按照224項(xiàng)下離體經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)的方法，分別將給藥1，3，6，12，24 h的皮膚全部剪下，進(jìn)行縱向冰凍切片，切片厚度20 μm，得到皮膚的橫截面。利用大黃酸的自發(fā)熒光特性，將其置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，選擇激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，進(jìn)行掃描攝圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖中從左到右依次為皮膚的角質(zhì)層、活性表皮、真皮，角質(zhì)層區(qū)域的熒光為綠色連續(xù)帶狀。熒光強(qiáng)度和藥物含量成正比關(guān)系，即熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，皮膚內(nèi)藥物含量越高。圖A為空白皮膚，無(wú)熒光； 圖B～F為不同種屬動(dòng)物神闕穴與非穴位皮膚，隨著時(shí)間推移，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，區(qū)域逐漸擴(kuò)大，說(shuō)明經(jīng)皮滲透量逐漸增高，動(dòng)態(tài)展現(xiàn)了藥物經(jīng)皮吸收的過(guò)程。圖B為大鼠神闕穴區(qū)皮膚，各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，說(shuō)明大黃酸透過(guò)的含量最高，與經(jīng)皮滲透試驗(yàn)結(jié)果一致。將家兔神闕穴（C）與非穴位區(qū)皮膚（D）比較，神闕穴區(qū)皮膚可見(jiàn)明顯的藥物富集區(qū)域，類(lèi)似貯庫(kù)。大鼠、家兔、小型豬的神闕穴區(qū)皮膚均可看到塊狀熒光區(qū)，而非穴位區(qū)只有點(diǎn)狀熒光區(qū)，提示穴位區(qū)的皮膚可能為藥物傳遞提供某種通道或載體，有助于藥物在皮膚中短暫滯留和進(jìn)一步滲透。

26皮膚厚度與經(jīng)皮滲透系數(shù)的相關(guān)性

采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件中的Pearson相關(guān)分析，分析皮膚厚度對(duì)不同種屬動(dòng)物神闕穴及大鼠腹部、側(cè)部、背部非穴位經(jīng)皮給藥的經(jīng)皮滲透系數(shù)之間的相關(guān)性。皮膚厚度對(duì)不同種屬動(dòng)物神闕穴經(jīng)皮給藥的經(jīng)皮滲透系數(shù)呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0747）；對(duì)大鼠腹部、側(cè)部、背部非穴位經(jīng)皮給藥的經(jīng)皮滲透系數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0948，P<005）。結(jié)果表明藥物吸收的經(jīng)皮滲透系數(shù)與皮膚厚度有一定相關(guān)性，且種屬差異大于部位差異；皮膚越厚，經(jīng)皮滲透系數(shù)越小，同一藥物濃度的穩(wěn)態(tài)透皮速率越低，藥物經(jīng)皮吸收越慢。

3討論

神闕穴位于任脈，為沖任循行之所，沖、任與督為“一脈三歧”，三脈經(jīng)氣相通，因奇經(jīng)八脈縱橫，故神闕貫穿于十二經(jīng)脈之中，氣通百脈。神闕穴位于機(jī)體臍部，臍為生命根蒂，神元?dú)w藏之本，五臟六腑之根，經(jīng)絡(luò)經(jīng)氣之總，有調(diào)節(jié)臟腑氣血功能的作用。因而神闕不僅是一個(gè)可見(jiàn)可觸的臍部穴位，更是一個(gè)包括中樞脈、祖竅、膻中在內(nèi)的微觀調(diào)控系統(tǒng)。薄智云等在臍周發(fā)現(xiàn)了與全身應(yīng)答關(guān)系明確、排布有序的穴區(qū)帶，認(rèn)為以神闕為軸的腹部不僅有一個(gè)與全身氣血運(yùn)行有關(guān)的循環(huán)系統(tǒng)，還有一個(gè)全身高級(jí)調(diào)控系統(tǒng)，即神闕穴調(diào)控系統(tǒng)，該理論認(rèn)為這個(gè)系統(tǒng)是敷臍療法和腹針的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。目前對(duì)中藥穴位給藥的研究主要集中在藥物傳遞、經(jīng)絡(luò)與神經(jīng)信息傳導(dǎo)等方面，本文利用經(jīng)皮給藥的現(xiàn)代藥劑學(xué)研究方法，比較大黃酸在神闕穴和非穴位皮膚中的透皮特性。

種屬和給藥部位差異對(duì)大黃酸透皮吸收存在影響，皮膚厚度是引起差異的間接因素之一，與皮膚的角質(zhì)層細(xì)胞層數(shù)、皮膚附屬器密度、皮膚的生化成分等因素亦密不可分。不同種屬動(dòng)物的皮膚厚度差異顯著，毛質(zhì)地不一，家兔的毛比較柔軟細(xì)密，小型豬的毛則稀疏粗硬；毛孔數(shù)量、毛囊大小等也都不同，這可能是造成大鼠、家兔、小型豬這3種動(dòng)物對(duì)大黃酸經(jīng)神闕穴皮膚的滲透系數(shù)有顯著性差異的主要因素，也有可能是穴位在不同種屬動(dòng)物上對(duì)藥物的刺激不同。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，合理使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是臨床前研究數(shù)據(jù)能否外推的重要基礎(chǔ)[15]。大黃酸神闕穴給藥經(jīng)皮滲透性存在一定的種屬差異，在經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物選擇以及將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人時(shí)應(yīng)考慮到不同動(dòng)物之間的種屬差異性。

參黃方組成為大黃、丹參、厚樸、枳實(shí)等，因考慮到小型豬皮膚角質(zhì)層較厚，有效成分透過(guò)量低，影響檢測(cè)，在對(duì)君藥大黃中5種游離蒽醌的經(jīng)皮滲透性比較的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大黃酸的滲透性最佳，穩(wěn)態(tài)透皮速率高于蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，因而以大黃酸原料藥代表參黃方進(jìn)行透皮試驗(yàn)，探討不同種屬動(dòng)物神闕穴及其與非穴位皮膚的吸收差異。

大黃酸是一種脂溶性藥物，幾乎不溶于水，難溶于生理鹽水和磷酸鹽緩沖液（PBS），在脂溶性藥物的透皮實(shí)驗(yàn)中，常加入一些表面活性劑或醇類(lèi)來(lái)改善其在接受液中的溶解度，從而維持漏槽條件[1719]。本文前期考察了大黃酸在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解度，其在10%，20%，30%，40%，50%乙醇中的溶解度分別為0015，0016，0024，0040，0063 g·L-1，且性質(zhì)穩(wěn)定。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別考察了含30%，20%，10%乙醇的生理鹽水及不含醇的生理鹽水作為接收液，結(jié)果含醇的生理鹽水不僅可以增加大黃酸的溶解度，而且有一定的促滲作用，為與生理環(huán)境接近，選擇含20%乙醇的生理鹽水作為接受液。

激光共聚焦顯微鏡對(duì)具有自發(fā)熒光特性的藥物，可以動(dòng)態(tài)、連續(xù)地掃描組織、細(xì)胞的固定范圍，記錄藥物的動(dòng)態(tài)變化，并定量分析，還可以獲得組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的三維圖像[20]，有望成為中藥滲透動(dòng)力學(xué)研究的新技術(shù)。熒光吸收?qǐng)D動(dòng)態(tài)展現(xiàn)了大黃酸在皮膚各層的滲透情況，可視化驗(yàn)證了其在神闕穴區(qū)皮膚的藥物含量高于非穴位區(qū)，神闕穴區(qū)皮膚出現(xiàn)熒光強(qiáng)度明顯的藥物富集區(qū)，類(lèi)似貯庫(kù)，這與相關(guān)文獻(xiàn)觀點(diǎn)一致[21]。藥物滲透快于非穴位區(qū)，為臨床施用參黃方敷貼神闕穴用于防治術(shù)后胃腸功能不全提供了實(shí)驗(yàn)支持。

穴位和非穴位差異對(duì)大黃酸神闕穴給藥經(jīng)皮滲透的影響較大，以往研究認(rèn)為皮膚厚度是影響藥物滲透的主要因素，本文對(duì)大黃酸神闕穴皮膚與周邊腹部皮膚的滲透試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)藥物的累積透過(guò)量、穩(wěn)態(tài)透皮速率與滲透系數(shù)存在顯著差異，經(jīng)神闕穴吸收高于非穴位皮膚，而兩者皮膚厚度相近，提示皮膚厚度只是引起穴位與非穴位區(qū)經(jīng)皮吸收差異的因素之一。

通過(guò)神闕穴與非穴位區(qū)皮膚離體經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)大黃酸經(jīng)神闕穴位皮膚的透過(guò)量高、透皮速率快，結(jié)合其在激光共聚焦顯微鏡下的熒光吸收?qǐng)D，初步判斷大黃酸神闕穴給藥的機(jī)制可能是經(jīng)絡(luò)在運(yùn)行氣血時(shí)，也為物質(zhì)傳遞提供通道、載體。根據(jù)中醫(yī)整體觀念，經(jīng)絡(luò)穴位受到神經(jīng)內(nèi)分泌及血液循環(huán)的影響，對(duì)于大黃酸神闕穴給藥經(jīng)皮吸收的機(jī)制研究還需要結(jié)合整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)藥物經(jīng)皮吸收后的分布進(jìn)行追蹤，因此大黃酸神闕穴給藥的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步從整體動(dòng)物水平進(jìn)行研究。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]