龍脈寧方中葛根素在心肌缺血大鼠體內藥動學慘┬а相關性研究

董林娟 張文娟 劉詩雨 王昌利 宋逍

[摘要]研究龍脈寧方中葛根素在正常及心肌缺血模型大鼠體內的藥動學過程及其與龍脈寧方抗心肌缺血作用的相關性。該文建立了大鼠皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（ISO）復制心肌缺血模型，灌胃給予FFLMN提取物溶液后不同時間點眼眶采血，HPLCUV檢測大鼠血漿中葛根素濃度，比較灌胃相同劑量FFLMN龍脈寧正常組和模型組大鼠體內藥動學差異。同時，采用酶標儀測定各時間點血漿中IL6及SOD活性，繪制藥效曲線。結果表明，正常組心肌缺血模型組大鼠血漿中葛根素濃度藥動學均符合二室模型，比較2組主要藥動學參數，葛根素在正常AUC0∞=（11451±3228） mg·h·L-1，AUC0t=（14047±3765） mg·h·L-1，Cmax=（5623±140） mg·L-1。治療組AUC0∞=（68849±50396 9） mg·h·L-1，AUC0t=（58312±45802） mg·h·L-1，Cmax=（18456±7517） mg·L-1。血漿中SOD水平顯著升高，IL6濃度顯著下降。表明與正常組相比，復方龍脈寧中葛根素在心肌缺血大鼠血漿中血藥濃度高，消除速度慢，生物利用度高，血漿中葛根素濃度與龍脈寧方抗心肌缺血作用有關，能夠升高SOD水平，抑制IL6的釋放。

[關鍵詞]復方龍脈寧； 葛根素； 心肌缺血； PKPD； SOD； IL6

[Abstract]To study the pharmacokinetics of puerarin in compound Longmaining（FFLMN） in normal rats and myocardial ischemia rats， and investigate its correlation with antimyocardial ischemia effect of FFLMN Models of myocardial ischemia rats were produced by subcutaneous injection of isoproterenol（ISO）， then FFLMN extract solution was administered by gavage Orbital sinus blood sampling was collected at different time points after gavage HPLCUV method was applied to determine the concentration of puerarin in plasma， and compare the difference in pharmacokinetics between normal rats and model rats after application of same dose of FFLMN Meanwhile， microplate reader was used to determine IL6 and SOD activities in plasma of different time points， and draw doseeffect curve The results indicated that the pharmacokinetics of puerarin conformed to the twocompartment model in both normal group and myocardial ischemia model group In the comparison of main pharmacokinetic parameters between two groups： AUC0∞=（11451±3228） mg·h·L-1，AUC0t=（14047±3765） mg·h·L-1， Cmax=（5623±140） mg·L-1 in normal group； AUC0∞=（68849±50396 9） mg·h·L-1， AUC0t= （58312±45802） mg·h·L-1，Cmax=（18456±7517） mg·L-1 in treatment group The SOD level was significantly increased and IL6 concentration was significantly decreased in plasma， indicating that as compared with the normal group， puerarin in FFLMN had a higher plasma concentration， slower elimination rate and higher bioavailability Therefore， puerarin concentration in plasma has correlation with the antimyocardial ischemia effect of FFLMN， which could increase SOD level and inhibit the release of IL6

[Key word]FFLMN； pueraria； myocardial ischemia； PKPD； SOD； IL6

doi：10.4268/cjcmm20160828

冠心病是指冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起的血管腔狹窄或阻塞，造成了心肌缺血、缺氧、壞死而導致的心臟病。近幾年，心腦血管疾病成為了一種嚴重危害人類健康的疾病。世界衛生組織在2008年發布，全球死亡人數中有29%是死于心腦血管疾病[1]。那么戰勝心腦血管方面疾病成為了人類醫療的一個重大問題。

復方龍脈寧（FFLMN）是由陜西中醫藥大學附屬醫院腦病科教授陶根魚根據自身多年臨床經驗所得的經驗方。全方由葛根、川芎、穿山龍、蜂膠4味藥組成，有通絡活血通絡、化瘀解毒的功效，在臨床上主要用于治療中風所導致的半身不遂、口眼歪斜、肢體麻木以及胸痹所致的心悸、胸悶、氣短等癥狀[2]。方中葛根是全方的君藥，現代藥理研究表明葛根中主要有效成分葛根素具有擴張冠狀動脈，改善心肌代謝，改善微循環，抗心律失常，降血壓等作用。所以，本文以葛根素為指標性成分進行檢測，來說明龍脈寧在大鼠體內的藥動學過程。

PKPD是指將藥物動力學和藥效動力學相結合，反映了機體與藥物之間的互相作用。其中，機體對于藥物的作用可以用藥動學模型表述，有吸收、分布、代謝、排泄4個環節，在模型中以體內血藥濃度隨時間的變化進行表述。藥物對于機體的作用可以在藥效學模型中反映，描述效應隨濃度而變化的藥效動力學過程[34]。本實驗以心肌缺血大鼠為實驗動物模型，以FFLMN中主要藥效成分葛根素為藥代指標，以超氧化物歧化酶（SOD）及白介素6（IL6）為藥效學指標[57]，建立PKPD模型，評價FFLMN在心肌缺血大鼠中藥動學及藥效學的相關性，為臨床抗心腦血管疾病提供合理依據[8]。

1材料

U3000型反相高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；iMark酶標儀，BioRad Laboratories，Inc；YZN50超高速真空低溫（濃縮）抽出機，北京東華原醫療設備有限責任公司總經銷；N1200B，EYELA旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；DZF6050真空干燥箱，上海恒科有限公司；HH2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；KH400KDE型高功率數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司； 1/1萬JMB5002電子天平，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司；XYJ2臺式高速離心機（江蘇）恒豐儀器廠；冷凍離心濃縮儀，DUC23050J00，青島路博偉業環保科技有限公司；MS2 IKA旋渦混合振蕩器，北京聯合科技有限公司。

葛根素對照品，純度≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院，批號110752201313；穿山龍、川芎購自西安盛興中藥飲片公司；葛根藥材購自寶雞向源中藥飲片有限責任公司，經陜西中醫藥大學藥學院生藥教研室王繼濤教授鑒定為豆科植物野葛的干燥根莖；蜂膠購自陜西省咸陽市自然之子蜂產品公司，經陜西中醫藥大學生藥教研室雷國蓮教授鑒定為正品蜂膠。超氧化物歧化酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL6，ELISA測定試劑盒購自R&D公司；鹽酸異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）購于Sigma公司；糧食乙醇（質量分數95%）和氯化鈉注射液購自辰欣藥業股份有限公司，批號1408132701；羧甲基纖維素鈉購自天津市天力化學試劑有限公司，批號20131029；甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

清潔級雄性SD大鼠，體重（280±20） g，購于中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心，合格證號SCXK（軍）2012006。動物飼養于陜西中醫藥大學藥學院藥理實驗室，提供標準動物飼料，自由進食飲水，實驗前夜禁食，自由飲水。

采用DAS 211藥代動力學軟件對血藥濃度進行數據處理，采用二房室模型計算主要動力學參數，實驗數據以±s表示。

2方法

21藥物的制備

稱取葛根1 200 g，川芎800 g，穿山龍800 g置于提取罐中，加入8倍量70%糧食酒精，提取3次，每次2 h，合并3次提取液，回收乙醇，離心，提取液濃縮至3 000 mL，稱取預處理過的AB8大空樹脂3 000 g裝柱，水洗至無醇味，上樣，80%乙醇05 BV·h-1洗脫，4 BV完全洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，水浴濃縮，真空干燥。按復方處方葛根川芎穿山龍蜂膠3∶2∶2∶1加入已除過蠟的蜂膠，混勻，制成FFLMN提取物。

22心肌缺血模型制備

取SD大鼠10只，用10%水合氯醛溶液以30 mL·kg-1大鼠腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術臺上，將針狀電極刺入大鼠四肢皮下，將心電圖靈敏度調節至1 mV=20 mm，走紙速度50 mm·s-1，穩定15 min后Ⅱ導聯描記大鼠心電圖。按50 mg·kg-1皮下（sc）多點注射ISO生理鹽水，每天注射1次，連續給藥3 d，復制心肌缺血模型。第2天造模后，測定大鼠心電圖，與造模前心電圖相比，以T波抬高、降低或倒置作為評價心肌缺血模型制備成功的指標[9]，篩選出5只造模成功的大鼠。

23給藥及血樣的采集

將大鼠分為正常組和模型組，各5只，正常組大鼠ig前于眼眶靜脈叢采集空白血，模型組在末次皮下注射ISO后30 min眼眶靜脈叢采集空白血，隨后ig給藥FFLMN提取物溶液10 mL·kg-1。所有大鼠給藥后017，033，05，075，1，2，3，4，6，8，10，12，24 h眼眶靜脈叢采血至肝素化EP管中，5 000 r·min-1冷凍離心10 min，吸取上清液，置-80 ℃冰箱，備用。

24大鼠血漿樣品中葛根素的測定

241色譜條件Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇水（21∶79），流速10 mL· min-1；檢測波長250 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

242葛根素對照品的配制精密稱取葛根素對照品264 mg于50 mL量瓶中，制成每1 mL含528 μg的對照品溶液作為儲備液。用甲醇梯度稀釋，配制成質量濃度分別為066，132，264，528，1056，112，5280 mg·L-1的葛根素對照溶液，置于4 ℃冰箱保存[9]。

243血漿樣品的制備取大鼠血漿100 μL，加400 μL甲醇，置渦旋振蕩3 min，1 000 r·min-1離心10 min，取全部上清液后在沉淀中加入200 μL甲醇再次渦旋離心，合并2次上清液。置冷凍離心濃縮儀中40 ℃離心干燥，樣品干燥后用流動相定容至100 μL，超聲10 min，渦旋混合1 min，再以1 000 r·min-1離心10 min，上清液過022 μm微孔濾膜。取10 μL，進樣。

244受試品的配制FFLMN提取物2566 g（相當于葛根素），加水定容至100 L，混合均勻，供大鼠灌胃用。

3結果

31方法學考察

311色譜行為及專屬性實驗空白血漿中加入葛根素對照品溶液配制成含葛根素2112 mg·L-1血漿樣品溶液，ig FFLMN 30 min后大鼠血漿樣品的色譜行為，色譜圖見圖1，結果表明葛根素與血漿中其他內源性雜質的分離效果良好。

312標準曲線的制備取葛根素系列對照溶液，以243項下方法處理，以葛根素血藥濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，做標準曲線，線性方程為y=0611 8x+0037 5，r=0999 7，表明葛根素在066～528 mg·L-1線性關系比較好。

313精密度試驗取空白血漿100 μL，分別配制成含葛根素質量濃度為2112，528，132 mg·L-1的血漿樣品各5份，按243項下方法處理，100 μL流動相復溶后保存于冰箱內，于日內同一樣品每隔2 h測定1次，共測定3次，計算日內、日間精密度，結果見表1，日內和日間RSD均<10%，符合藥動學檢測要求。

314穩定性試驗取空白血漿100 μL， 加入高，中，低3種不同質量濃度葛根素對照品溶液，各5份，分別考察室溫放置4 h，4 ℃冰箱放置4 h，置-20 ℃反復凍融3次，-20 ℃放置7 d后，樣品按243項下方法處理，檢測，計算樣品穩定性。發現樣品中葛根素含量無明顯降解，室溫、凍融等狀態下均保持穩定，其中高、中、低3種質量濃度的RSD分別為15%，092%，20%。

315回收率試驗流動相配制高、中、低（相當于葛根素質量濃度2112，528，132 mg·L-1）標品溶液各5份，測定其峰面積作為A1。 取空白血漿100 μL，配制葛根素高、中、低3種濃度各5份，按243項下方法處理，加100 μL流動相復溶，測得峰面積為A2。另取空白血漿100 μL，以23項下方法處理后，加入高、中、低3種不同濃度的葛根素對照溶液，測得的峰面積為A3。以A2/A1為方法回收率，A2/A3作為提取回收率，結果見表2，提取回收率和方法回收率均在要求的范圍內，所以該方法合理可行[9]。

32大鼠血漿樣品中SOD和IL6的測定

按照試劑盒使用說明書操作，采用黃嘌呤氧化法測定大鼠血漿樣品中SOD活性，雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定血漿中IL6濃度。

33藥代動力學試驗

正常組與心肌缺血組大鼠ig FFLMN提取物后，葛根素血藥濃度隨時間呈動態變化，其藥時曲線見圖2，主要藥動學參數見表3。藥動學數據顯示FFLMN中葛根素在正常及心肌缺血大鼠體內的藥動學過程存在一定的差異。結合2組之間的t1/2β，AUC0∞，Cmax等藥動學數據可知，與正常組相比，葛根素在心肌缺血大鼠體內血藥濃度高，吸收率好，且在體內消除速率慢，滯留時間比較長。說明方中葛根素在心肌缺血疾病大鼠體內的生物利用度與正常大鼠相比生物利用度大大增加，有利于藥效發揮，為臨床合理用藥提供實驗依據[9]。

34藥效學結果

正常組大鼠空白血漿中SOD為（15478±429） U·mL-1，IL6為（3029±587） ng·L-1，經實驗研究發現正常組SOD和IL6在灌胃復方后隨時間變化不明顯，故未做統計，與正常組相比，模型組大鼠空白血漿中SOD為（12421±1197） U·mL-1，顯著降低，IL6為（7934±751） ng·L-1，升高明顯。表明心肌缺血模型造成了大鼠體內缺氧和炎癥的發生。模型組大鼠給予FFLMN提取物后血漿中SOD水平有所回升，IL6濃度明顯降低，模型組ig給藥后大鼠血漿中SOD與IL6隨時間變化時效變化，見圖3，FFLMN提取物可以有效改善大鼠心肌缺血所帶來的缺氧和炎癥等因素[10]。

35藥動學與藥效學相關性擬合

依據上述藥動學和藥效學實驗結果，對心肌缺血組FFLMN方中指標性成分葛根素的藥動學和藥效學數據進行擬合，結合藥動學擬合出濃度時間效應曲線，見圖4。從圖中可以看出大鼠ig FFLMN提取物后，血漿中葛根素的濃度與SOD活性在0～072 h內成正比趨勢增長，072～1 h葛根素濃度開始逐漸下降，SOD增長到最高水平，之后SOD開始下降，4 h后SOD的活性慢慢趨向正常值。血漿中IL6的濃度在0～05 h成一定的上升趨勢，05 h后隨著血漿中葛根素濃度的繼續增大，IL6的濃度開始降低，3 h后血漿中IL6濃度逐漸趨于正常[11]。

4討論

本實驗同時研究FFLMN中葛根素在心肌缺血及正常大鼠體內的藥動學特征，結果顯示在心肌缺血模型體內葛根素的吸收效果明顯優于正常組，同時代謝速度慢于正常組，這種差異一方面應該是與心肌缺血“證”相聯系的，表明用FFLMN治療心肌缺血疾病的臨床合理性，反映中醫理論上的方證對應思想[12]。另一方面可能源于缺血機體會導致代謝物的消除速度減慢。實驗中大鼠灌胃的劑量在臨床用藥大劑量組的基礎上增加了10倍。

近代藥理研究表明，心、腦血管類藥物的抗心肌缺血作用涉及抗氧化、抗炎證、擴張冠狀動脈硬化、促進血管新生及誘導血管內皮松弛因子NO的釋放等多種機制的變化[13]。本課題前期的藥理研究發現，FFLMN對寒凝血瘀及藥物等因素所致的心肌缺血動物均具有一定的治療和保護作用[1415]。本實驗是在此基礎上，以心肌缺血大鼠血漿中SOD，IL6水平與葛根素的血藥濃度為依據建立PKPD模型，進一步研究了FFLMN中葛根素在心肌缺血大鼠體內藥動學藥效學相關性，建立了龍脈寧方的藥效學與藥動學同步分析統一模型。在研究中發現病理組大鼠在ig龍脈寧提取物后血漿中葛根素與效應有一定程度的滯后現象，在前期文獻研究中發現，大多數藥物都具有此類現象[16]，產生這種現象的原因大致有3種：第1種是由效應室引起的滯后，藥物由中央室傳遞到效應室需要一定的平衡時間，造成效應滯后的現象；第2種是由藥物在中央室分布從而造成的滯后；第3種就是藥物起效需要一定時間所造成的滯后，許多藥物到達效應部位較快，然而起效較慢[17]。具體是哪種現象所引起的效應滯后現象還需進一步探討。同時，FFLMN方中有4味藥物，但由于復方的復雜性和效應的多樣性，另外3味中藥的指標成分在該方治療心肌缺血疾病中是否會產生協同作用及其與藥效之間的關系有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]李冉， 金青. 心血管系統藥物的PKPD模型研究進展[J]西北藥學雜志，2011，26（5）：387

[2]王昌利， 王莎， 史亞軍， 等. 復方龍脈寧不同配比藥效學實驗研究[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2014，16（7）：7

[3]曹崗， 張云， 叢曉東，等. PKPD模型在中藥藥動學中的應用[J]. 中草藥，2009，40（11）：1830

[4]Sheiner L B， Stanski D R， Vozehs， et al. Simultaneous modeling of pharmacokinetics and pharmacodynamics：application to Dtubocurarine[J]. Clin Pharmacol Ther，1979，25（3）：358

[5]劉虹， 徐慶科， 夏偉， 等. 冠心病與炎癥因子IL6、IL8、IL10、hsCRP及TNF的相關性研究[J]. 實用心腦肺血管病雜志， 2011， 19（9）：1446

[6]鞏紅巖， 秦元旭， 王更富， 等. 葛根素對大鼠外循環后心肌缺血再灌注損傷的保護作用及抗氧化應激機制的探討[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2012，18（1）：165

[7]董林娟， 熊沙沙， 劉鑫華， 等. 葛根提取物在正常及心肌缺血大鼠體內藥物代謝動力學研究[J]. 中南藥學， 2015，13（10）：1054

[8]艾進超， 周惠芬， 舒明春， 等. 丹參素在局灶性腦缺血大鼠體內藥動學藥效學相關性研究[J]. 中國中藥雜志，2014， 39（14）： 2751

[9]宋延平，孔令姍，吳靜，等.丹酚酸A與丹酚酸B改善大鼠心肌缺血作用比較[J].中國中醫藥信息雜志，2007， 14（9）：36

[10]詹淑玉， 邵青， 李正， 等. 生脈注射液中人參皂苷Rg1，Rb1在心肌缺血大鼠體內的藥動學藥效學結合研究[J]， 中國中藥雜志，2014， 39（7）： 1300

[11]朱華旭， 張新龍， 曾明飛， 等. 黃連解毒湯中小檗堿在腦缺血模型大鼠體內藥動學與藥效學相關性研究[J]中草藥，2012， 43（3）：546

[12]曾明飛， 潘林梅， 朱華旭， 等. 黃連解毒湯中梔子苷在正常及腦缺血大鼠體內藥動學研究[J]. 中草藥，2010，41（4）：617

[13]Derendorf H， Lesko L J， Chaikin P， et al. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling in drug research and development[J]. J Clin Pharmacol， 2000，40（12 pt 2）：1399

[14]張文娟， 董林娟， 宋逍， 等. 復方龍脈寧不同提取液對小鼠急性心肌缺血缺氧損傷的保護作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2015，26（5）：618

[15]王莎， 王昌利， 史亞軍， 等. 復方龍脈寧對寒凝血瘀大鼠的實驗研究[J]. 中醫藥學報，2014，42（6）：48

[16]Chu K M， Hu O Y， Shieh S M. Cardiovascular effect and simuleaneous pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling of pimobendan in healthy normal subjects[J]. Drug Metab Dispos，1999，27（6）：701

[17]楊昭毅， 魏偉. 藥代動力學藥效動力學結合模型研究進展[J]. 中國藥理學通報，2005， 21（8）： 918

[責任編輯曹陽陽]