灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗方法與分級標準研究

張應(yīng) 徐進 李隆云 崔廣林 佘躍輝

[摘要]參照《中國農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》，研究扦樣、凈度、千粒重、真實性、水分、生活力、相對電導(dǎo)率、發(fā)芽等灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗方法；對38份不同來源的種子做質(zhì)量檢驗，采用K均值聚類制定質(zhì)量分級標準。結(jié)果表明：灰氈毛忍冬種子最少試驗量為75 g，過20目篩進行凈度分析，五百粒法測定千粒重，種子粉碎高恒溫（130±2）℃烘干3 h測定水分含量，01%TTC溶液25 ℃避光染色5 h測定生活力，10 g種子在25 ℃超純水中浸泡12 h測定相對電導(dǎo)率，4 ℃下沙藏層積80 d后置于15 ℃光照紙床進行發(fā)芽試驗；不同來源種子按質(zhì)量分為3個等級，初步制定了種子質(zhì)量分級標準。生產(chǎn)上建議使用Ⅰ級和Ⅱ級種子。

[關(guān)鍵詞]灰氈毛忍冬；種子；質(zhì)量檢驗；分級標準

[Abstract] Referring to the rules for agricultural seed testing （GB/T 35431995） issued by China， the test of sampling， purity， thousand seed weight， moisture， viability， relative conductivity and germination rate had been studied for seed quality test methods of Lonicera macranthoides. The seed quality from 38 different collection areas was measured to establish quality classification standard by Kmeans clustering The results showed that at least 75 g seeds should be sampled， and passed 20mesh sieve for purity analysisThe 500seed method used to measure thousand seed weight The moisture was determined by crushed seeds dried in high temperature （130±2 ℃） for 3 hThe viability determined by 25 ℃ 01% TTC stained 5h in dark 10 g seeds soaked in 50 ml ultra pure water in 25 ℃ for 12 hours to determine the relative conductivity The seed by 4 ℃stratification for 80 days were cultured on paper at 15 ℃. Quality of the seeds from different areas was divided into three grades The primary seed quality classification standard was establishedThe I grade and II grade were recommend use in production

[Key words]Lonicera macranthoides； seed； quality test methods； quality classification standard

doi：10.4268/cjcmm20160812

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides HandMazz為忍冬科忍冬屬多年生藤本植物，是我國重要大宗藥材山銀花的基原植物之一，花蕾含有有機酸、黃酮類、皂苷類等化學(xué)成分，具有清熱解毒，涼散風(fēng)寒的功效，社會需求量極高[12]。灰氈毛忍冬生態(tài)適應(yīng)性強、產(chǎn)量高、采摘方便、綠原酸含量高，在重慶、湖南、貴州、四川等地廣泛種植[3]。

灰氈毛忍冬實生苗繁育成本低、根系活性強，是采用嫁接技術(shù)繁育良種的優(yōu)質(zhì)砧木材料，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用[46]。但不同產(chǎn)地和成熟程度的灰氈毛忍冬種子質(zhì)量差異懸殊，嚴重制約實生苗的生產(chǎn)，迫切需要建立灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗和分級標準。目前對灰氈毛忍冬的研究主要集中在化學(xué)成分、藥材質(zhì)量、栽培技術(shù)等方面，未見種子質(zhì)量相關(guān)研究[2，4，612]。本文開展灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢測方法的研究，測定不同來源灰氈毛忍冬種子質(zhì)量，初步建立了灰氈毛忍冬種子質(zhì)量評價體系和分級標準。

1材料與方法

11樣品

用于質(zhì)量檢驗方法研究的種子，于2014年11月采自重慶市江津區(qū)柏林鎮(zhèn)東勝村灰氈毛忍冬種植基地。用于質(zhì)量標準研究的種子，于2014年11月分別采自重慶、四川、湖南、貴州等灰氈毛忍冬主產(chǎn)地，共38份，種子編號和具體產(chǎn)地見表1。所有種子均為漿果采收后揉碎，水沖過濾殘渣，自然風(fēng)干而得，經(jīng)重慶市重中藥研究院李隆云研究員鑒定為灰氈毛忍冬L macranthoides種子。用于發(fā)芽試驗的種子自然風(fēng)干后置于4 ℃濕沙中層積80 d。

12種子質(zhì)量檢驗方法研究

121扦樣參照GB/T 354321995“農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程——扦樣”，采用“四分法”扦取初次樣品和試驗樣品。根據(jù)灰氈毛忍冬種子的市場流通情況和單次可能交易量，凈度分析樣品不少于2 500粒種子，送檢樣品為凈度分析樣品10倍量。

122凈度分析扦樣得到的種子過20目篩，篩除小型雜質(zhì)和果皮，置于種子凈度工作臺上，將凈種子、廢種子、果皮和果柄，泥沙以及其他雜質(zhì)分開并稱重，重復(fù)3次。

種子凈度=[凈種子/（凈種子+廢種子+果皮和果柄+泥沙及其他）]×100%

123千粒重測定采用百粒法、五百粒法和千粒法3種方法對種子重量進行測定。①百粒法：從凈種子中隨機選取100粒稱重，重復(fù)8次； ②五百粒法：從凈種子中隨機選取500粒稱重，重復(fù)3次； ③從凈種子中隨機選取1 000粒稱重，重復(fù)3次。計算出標準差和變異系數(shù)。重復(fù)間變異系數(shù)<40%，測定值有效。

124種子真實性鑒定隨機選取100粒灰氈毛忍冬種子，觀察種子顏色、形態(tài)及表面特征，測量種子的長、寬、厚，記錄數(shù)據(jù)。

125水分測定分別采用低溫恒溫烘干法和高溫恒溫烘干法2種方法。

分別稱取2份2 g種子，1份直接放入潔凈干燥的鋁盒中，另1份種子粉碎后放入潔凈干燥的鋁盒中，磨碎細度為50%以上通過05 mm孔徑的金屬篩，而留在10 mm篩孔的不超過10%。將鋁盒置于（105±2） ℃（低恒溫烘干）或者（130±2） ℃（高恒溫烘干）恒溫烘箱，每隔1 h取出放入干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱重并記錄，測定時樣品暴露在空氣中的時間應(yīng)少于2 min。總烘干時間6 h，重復(fù)4次。

種子水分=[（烘前試樣重-烘后試樣重）/烘前試樣重]×100%

126生活力測定將種子于（25±1） ℃浸種過夜，沿胚中軸線切成兩半。分別用01%，02%，04%，06%，08% TTC溶液，25 ℃避光染色，分別于染色1，2，3，4，5，6，24 h后記錄生活力。50個半粒為1個重復(fù)，每個處理重復(fù)3次。另取50粒不切開種子染色觀察。

127相對電導(dǎo)率測定分別將05，10，15 g種子用蒸餾水和重蒸餾水各沖洗2遍，浸泡在50 mL蒸餾水中，置于（25±1） ℃恒溫箱中，分別測定初始電導(dǎo)率a1，浸泡2，4，8，12，16，24，32 h時的電導(dǎo)率a2，以及將種子和浸泡液煮沸30min后冷卻至室溫的電導(dǎo)率a3。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

相對電導(dǎo)率=（a2-a1）/（a3-a1）×100%

128發(fā)芽試驗種子在4 ℃條件下沙藏沉積80 d后，15 ℃光照恒溫紙床培養(yǎng)，每重復(fù)60粒種子，3次重復(fù)，置床后第4天為首次計數(shù)時間，第23天為末次計數(shù)時間。以芽長為種子長度的1/2為萌發(fā)標準。

發(fā)芽率GP =（23 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽勢GE=（13 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

霉變率MP=（24 d內(nèi)霉變的種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)GI =Σ（Gt/Dt）

式中Gt表示在第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dt代表相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

13種子分級標準研究

采用上述研究確定的檢驗方法，對38份灰氈毛忍冬種子進行凈度、千粒重、含水量、生活力、相對電導(dǎo)率、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、霉變率共9個指標的測定。使用SPSS 190統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述、相關(guān)分析、主成分分析和K均值聚類分析。

2結(jié)果與分析

21扦樣

采用四分法扦取灰氈毛忍冬種子試樣，種子凈度分析試驗所需試樣的最少量為75 g（不少于2 500粒種子），送檢樣品最少為750 g。

22凈度分析

凈度分析結(jié)果見表2，3次重復(fù)種子的增失差均未偏離原始質(zhì)量的5%，故該方法和程序切實可行。

23千粒重測定

千粒重測定結(jié)果見表3，百粒重變異系數(shù)最大，達828%，超過允許的變異系數(shù)40%，測定值無效。千粒法、五百粒法變異系數(shù)分別為163%，260%，均未超過允許的變異系數(shù)，測定值有效，所以千粒法和百粒法都可用于灰氈毛忍冬的質(zhì)量測定，實際操作中，為減少工作量，以五百粒法作為灰氈毛忍冬種子千粒重的測定方法。

24真實性鑒定

灰氈毛忍冬種子為扁近橢圓形或三角狀卵形，稍扁，長172～442 mm，寬114～353 mm，厚035～135 mm；種皮革制，種子背面中部有凸起的脊，脊兩側(cè)有2條明顯的凹溝，腹面脊不明顯。頂端稍圓，基部稍尖；表面灰褐色或褐色；種臍位于極軸一端。種子千粒重為1562～4910 g。

25水分測定

不同方法測定的種子水分結(jié)果見表4，2因素方差分析表明，測定方法和烘干時間對種子水分的主效應(yīng)極顯著（P=0000，P=0000）。種子整粒低恒溫（105±2） ℃烘干4 h后水分含量不發(fā)生顯著變化，其他處理方法3 h后水分含量不發(fā)生顯著變化。不同測定方法測定結(jié)果差異顯著，種子粉碎高恒溫（130±2） ℃測得的含水量顯著高于其他處理方法。因此，以種子粉碎高恒溫（130±2） ℃烘干3 h作為測定灰氈毛忍冬種子含水量的方法。

26生活力測定

不同TTC濃度、染色時間測定的種子生活力結(jié)果見表5。01%，02%，04%，06%TTC染色5 h后，08%TTC染色4 h后，染色半粒種子數(shù)量無顯著增加，且放置24 h后，染色種子數(shù)均保持不變。相同染色時間，不同濃度TTC測定的生活力差異顯著，染色5 h后，01% TTC測定的結(jié)果顯著高于其他濃度。整粒種子無法正常染色。因此將01%TTC溶液恒溫（25±1） ℃染色5 h作為測定灰氈毛忍冬生活力的方法。

27相對電導(dǎo)率測定

不同質(zhì)量的種子在（25±1）℃的超純水中浸泡不同時間的相對電導(dǎo)率測定結(jié)果見表6。隨著浸泡時間相對電導(dǎo)率呈上升趨勢；05 g種子浸泡8 h后相對電導(dǎo)率與12，16，24 h無顯著差異，32 h后顯著上升；10，15 g種子浸泡12 h后相對電導(dǎo)率無顯著上升，32 h顯著上升。05 g種子浸泡8 h測定的相對電導(dǎo)率變異系數(shù)634%，10，15 g種子浸泡12 h測定的相對電導(dǎo)率變異系數(shù)分別為201%，223%。因此，將10 g種子浸泡在50 mL超純水中12 h的測定相對電導(dǎo)率。

28發(fā)芽試驗

對灰氈毛忍冬發(fā)芽適宜條件的研究另文報道。本研究采用將種子置4 ℃條件下沙藏層積80 d后，15 ℃光照恒溫紙床培養(yǎng)，每重復(fù)60粒種子，3次重復(fù)，首次計數(shù)為置床后第4天，末次計數(shù)為第23天，統(tǒng)計發(fā)芽勢的時間為置床后第13天。

29種子質(zhì)量檢驗方法

本文從扦樣、凈度、千粒重、真實性、含水量、生活力、相對電導(dǎo)率、發(fā)芽等8個方面對灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗方法進行了研究，確定了適宜于灰氈毛忍冬質(zhì)量檢驗方法，見表7。

210種子分級標準

2101種子質(zhì)量檢測結(jié)果根據(jù)表7所示的灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗方法，測定38份種子的凈度、含水量、千粒重、生活力、相對電導(dǎo)率、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和霉變率共9個質(zhì)量指標，結(jié)果見表8。

2102分級指標的確定對38份種子質(zhì)量指標的相關(guān)分析結(jié)果見表9。結(jié)果表明：生活力與發(fā)芽率、發(fā)芽勢和霉變率極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0641，0518，-0529；相對電導(dǎo)率與發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、霉變率極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0736，-0628，-0511，0492；且生活力與相對電導(dǎo)率極顯著相關(guān)，因此生活力、相對電導(dǎo)率均能在一定程度上反應(yīng)種子的活力，表征種子的發(fā)芽潛力，可用于種子質(zhì)量的快速檢驗。發(fā)芽率與發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、霉變率極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0838，0601，-0732。

以38份種子的質(zhì)量檢查結(jié)果為基礎(chǔ)，做主成分分析計算出各主成分的特征向量和貢獻率，并根據(jù)向量的絕對值將不同質(zhì)量指標劃分到不同的主成分之中，結(jié)果見表10。主成分因子1和因子2特征值大于1，累計貢獻率達6737%，具有較強的信息代表性，因此可以用這2個主成分因子對種子質(zhì)量進行概括。決定第一主成分大小的主要是發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對電導(dǎo)率和凈度4個性狀分量，其中發(fā)芽率特征向量達-0903，是灰氈毛忍冬種子分級的最主要指標。決定第二主成分大小的主要是千粒重和含水量。根據(jù)相關(guān)性分析和主成分分析的結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)上的實踐經(jīng)驗和檢驗的可操作性，建議使用發(fā)芽率、相對電導(dǎo)率、凈度、千粒重和含水量5個指標作為質(zhì)量分級的指標。

2103質(zhì)量分級標準采用SPSS分析軟件對38份灰氈毛忍冬種子發(fā)芽率、相對電導(dǎo)率、凈度、含水量和千粒重5項指標做K均值聚類分析，最終類中心值見表11。在最終類中心值的基礎(chǔ)上，發(fā)芽率、凈度采用縫小數(shù)點取整數(shù)法，相對電導(dǎo)率、千粒重、含水量尾數(shù)采用0～5或5～10逢05進位取整法，修約后的灰氈毛忍冬種子質(zhì)量級標準見表12。分級方法采用最低定級原則，即任何一項指標不符合規(guī)定標準都不能作為相應(yīng)等級的合格種子。根據(jù)修約后的種子質(zhì)量標準，38份灰氈毛忍冬種子中，Ⅰ 級種子有9份，Ⅱ 級種子有14份，Ⅲ 級種子有15份。

3結(jié)論與討論

本文開展了對灰氈毛忍冬種子質(zhì)量檢驗方法的研究，并對不同產(chǎn)地的灰氈毛忍冬種子質(zhì)量指標進行檢驗，通過相關(guān)、主成分和聚類分析，確定以發(fā)芽率、相對電導(dǎo)率、凈度、千粒重和含水量5項指標初步制定了灰氈毛忍冬種子質(zhì)量分級標準。Ⅰ級和Ⅱ級種子質(zhì)量較好，能滿足灰氈毛忍冬種子生產(chǎn)的基本要求，建議生產(chǎn)上使用。

本文通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)TTC法測定的生活力和相對電導(dǎo)率，在一定程度上能反應(yīng)種子的發(fā)芽能力，可用于種子活力的快速檢測。千粒重與發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著相關(guān)，與發(fā)芽指數(shù)極顯著相關(guān)，千粒重反應(yīng)種子貯藏物質(zhì)的多少，影響種子苗的前期發(fā)育，可能對種子活力有一定的影響。凈度和含水量與發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)極顯著相關(guān)，2個指標主要受人為因素影響，與種子生物特性無直接相關(guān)性，可能是本研究樣品質(zhì)量差異較大的原因，在數(shù)據(jù)上發(fā)生相關(guān)。

主成分分析篩選出發(fā)芽率、發(fā)芽勢、相對電導(dǎo)率、凈度、千粒重和含水量6個對灰氈毛忍冬質(zhì)量影響較大的指標，其中發(fā)芽率是最重要的指標。發(fā)芽率直接反應(yīng)種子在田間的出苗率，以其為最重要的質(zhì)量指標與生產(chǎn)需求相符合。相對電導(dǎo)率用于快速判斷種子活力，可作為發(fā)芽率的替代指標。一般而言，種子活力越高，膜功能越強大，滲透物越少，相對電導(dǎo)率越低；種子活力越低，細胞膜受到損傷，內(nèi)容物越容易滲透出來，相對電導(dǎo)率越高[14]。凈度是種子交易的依據(jù)，含水量決定種子安全貯藏和種子壽命，千粒重反映種子飽滿、成熟程度和幼苗長勢，3個指標都應(yīng)作為次重要的質(zhì)量指標[15]。發(fā)芽勢與發(fā)芽率極顯著相關(guān)，為了簡化工作，減少發(fā)芽勢指標，最終確定5個指標作為灰氈毛忍冬質(zhì)量評價的指標。

灰氈毛忍冬種子發(fā)芽率很低，一方面與種子生物特性相關(guān)，一方面霉菌污染也制約了種子發(fā)芽。本實驗中發(fā)現(xiàn)，種子霉變率在5%～6722%，是影響種子正常發(fā)芽的主要因素，通過一定的抑菌處理，可以在一定程度上提高灰氈毛忍冬種子的發(fā)芽率。關(guān)于灰氈毛忍冬種子發(fā)芽過程中的霉菌控制方法，還有待于進一步研究。

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[責任編輯呂冬梅]