決明子水提液對大鼠肝臟CYP450酶的影響

許龍龍 湯響林 馬增春 王宇光 梁乾德 譚洪玲 肖成榮 李樺 原梅 高月

[摘要]該文研究決明子水提液對大鼠肝臟CYP450酶酶活性、mRNA及蛋白表達水平的影響。取SD大鼠，口服灌胃受試藥物后，處死，用冰冷生理鹽水灌流肝臟，提取大鼠肝臟微粒體、肝臟總RNA和總蛋白，采用 Cocktail體外孵育法結合液質聯用（LCMS）技術對大鼠肝臟中CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1，3A1各亞酶的酶活性進行測定，并應用熒光定量PCR技術和Western blot對上述亞型的 mRNA和蛋白表達水平進行檢測。結果表明，酶活性方面，決明子水提液組與空白組比較可明顯誘導CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1，3A1的酶活性，其中決明子低劑量組對CYP2D2有明顯的抑制作用，中、高劑量組對CYP2D2有明顯的誘導作用，且都呈劑量依賴性增加，但對CYP3A1的誘導不呈劑量依賴性；mRNA表達方面，決明子水提液對CYP1A2，2C11，2D2，2E1 mRNA的表達具有顯著誘導作用，其中對CYP1A2，2D2，2E1誘導作用呈劑量依賴性，與酶活性水平具有一致性，對CYP2B1，3A1沒有明顯作用；蛋白表達方面，決明子水提液對CYP2C11，2E1的表達也具有誘導作用，但沒有統計學差異。決明子水提液對CYP450同工酶不同程度誘導或抑制作用，特別是對于CYP2C11，2E1亞型酶，酶活性與mRNA，蛋白表達水平具有一致性，提示當與這些酶底物合并用藥時，尤其是與CYP2C11，2E1代謝有關的藥物合用時，應充分考慮到潛在的有益和不利的藥物相互作用。

[關鍵詞]決明子；細胞色素P450酶；Cocktail探針法；熒光定量PCR技術；Western blot

[Abstract]To study the effect of aqueous extract of Cassiae Semen on the activity， mRNA and protein expressions of cytochrome P450（CYP450） system in rat liver microsomes， microsomes of rat liver were prepared after the oral administration with aqueous extract of Cassiae Semen for 14 days The enzyme activity was quantified by Cocktail method Meanwhile， the mRNA and protein expressions of CYP1A2， CYP2B1， CYP2C11， CYP2D2， CYP2E1 and CYP3A1 in the livers were detected by RTPCR and Western blot The result of this experiment was that aqueous extract of Cassiae Semen obviously induced the enzyme activities of CYP1A2， CYP2B1， CYP2C11， CYP2D2， CYP2E1 and CYP3A1 Low dose of aqueous extract of Cassiae Semen significantly reduced the activity of CYP2D2， but the activity of CYP2D2 was significantly induced by middle dose and high dose of aqueous extract of Cassiae Semen These subtypes were increased in a dosedependent manner except for CYP3A1 The mRNA levels of CYP1A2， CYP2C11， CYP2D2 and CYP2E1 were also induced in rats treated with aqueous extract of Cassiae Semen， but with no significant effect in CYP2B1 and CYP3A1 mRNA expressions The protein levels of CYP2C11 and CYP2E1 were also induced in rats treated with aqueous extract of Cassiae Semen， but with no significant difference Since the enzyme activity， mRNA and protein expressions of CYP450， particularly CYP2C11and2E1subtypes， were induced or inhibited by aqueous extract of Cassiae Semen to varing degrees， suggesting the potential drugdrug interactions should be concerned

[Key words]Cassiae Semen；cytochrome P450；Cocktail probe method；QPCR； Western blot

doi：10.4268/cjcmm20160823

決明子為豆科植物Cassia obtusifolia L或小決明C tora L的干燥成熟種子，始載于《神農本草經》列為上品藥，為我國藥典收載的常用中藥[1]，其性味甘、苦、咸，微寒，歸肝、大腸經，具清熱明目、利水通便的功效。決明子具有多種藥理作用，主治目赤澀痛、羞明多淚、頭痛、眩暈、小便不利、習慣性便秘等。現代藥理研究證明決明子具有降血壓、降血脂、保肝、抗菌等活性，同時又可作為保健飲品的原料[2]。

目前國內外對決明子的研究主要集中在化學成分、保肝降脂機制[34]等研究，決明子作為傳統的中藥材，其一直既是食品又是藥品的物品，可以長期使用，周宇紅等[5]研究決明子長期服用，可引起腎、腸系膜淋巴結、睪丸等靶器官病理改變，提示決明子不宜長期大量服用，因此決明子主要成分蒽醌衍生物的潛在不良反應應引起足夠的重視，而藥物相互作用是臨床上產生嚴重不良反應甚至死亡的主要原因之一。細胞色素P450（cytochrome P450）作為人體重要I相藥物代謝酶系統，其對藥物代謝和藥物之間的相互作用有著重要影響[6]。在臨床應用中，決明子與其他藥物聯合應用，有發生藥物相互作用的可能，并由此改變相關藥物的血藥濃度，甚至引起不良反應的發生。此前關于決明子對藥物代謝酶影響的研究相對較少，缺乏該藥物對藥物代謝酶影響的基礎數據。

根據本實驗室已經建立的混合探針的測定方法，選擇了大鼠體內相對應的6種亞型進行研究，利用液質聯用技術[7]測定了決明子水提液對大鼠CYP450亞酶酶活性的影響，同時利用熒光定量PCR技術、Western blot對大鼠 CYP450同工酶mRNA和蛋白表達進行了檢測，從3個層面發現了決明子水提液對藥物代謝酶亞型的影響，為臨床合理使用該藥提供參考[8]。

1材料

決明子購自北京同仁堂，產地安徽，批號20150201，由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所馬百平研究員鑒定；非那西丁/對乙酰氨基酚（phenacetin/paracetamol），甲苯磺丁脲/4羥基甲苯磺丁脲（tolbutamide/4hydroxytolbutamide），右美沙芬/右啡烷（dextromethorphan/dextrorphan），氯唑沙宗/6羥基氯唑沙宗（chlorzoxazone/6hydroxychlorzoxazone）均購自Sigma 或 BD Genetest公司；安非他酮/4羥基安非他酮（bupropion/4hydroxybupropion），咪達唑侖/1羥基咪達唑侖（midazolam/1hydroxymidazolam）購自中國食品藥品檢定研究院；NADPH購自瑞士Roche公司；超純總RNA快速提取試劑盒購自中國博邁德（Biomed）公司；反轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒及QPCR擴增試劑盒購自北京全式金（TransGen）公司；甲醇和乙腈為色譜純，購自美國SigmaAldrich公司；實驗用水為超純水。

Agilent 1290型超高效液相色譜儀（UHPLC，美國Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四級桿串聯質譜儀（美國Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipseC18色譜柱（21 mm×100 mm，35 μm，美國Agilent公司）；ImageQuant LAS 500顯影儀；RE52CS型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；SHBⅢA循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Optima LXP超高速低溫離心機（美國Beckman）；DY891勻漿機（中國寧波新芝生物科技有限公司）；Labofuge 400R高速低溫離心機（德國Heraeus）；ABI Step One Plus 熒光定量PCR儀；BS223S電子天平（德國Sartorious公司）；pH計（METTLER TOLEDO）；QM20型制冰機；純水儀（Millipore Simplicity）。

雄性SD大鼠，SPF級，體重180～220 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號SYXK（軍）2015004，動物合格證號SCXK（軍）2015004。動物隨機分為5組，每組9只，分別為空白組，苯巴比妥組，決明子低劑量組、中劑量組、高劑量組。

2方法

21給藥方案

苯巴比妥組腹腔注射給予80 mg·kg-1·d-1苯巴比妥鈉，第12天開始注射，連續3 d，第15天制備肝微粒體；決明子低劑量組（15 g·kg-1·d-1，根據《中國藥典》，由人臨床劑量換算成大鼠等效劑量），決明子中劑量（5 g· kg-1·d-1，相當于3倍人臨床劑量），決明子高劑量（15 g· kg-1·d-1，相當于9倍人臨床劑量），連續灌胃14 d，第15天脫臼處死動物制備肝微粒體；空白組給予等量生理鹽水，連續14 d，第15天制取肝微粒體。

22供試樣品的制備

決明子水提液的制備： 取決明子500 g，置圓底燒瓶中，加水4 000 mL浸沒藥材，浸泡30 min 后，加熱至煮沸，保持微沸60 min，分離煎出液，藥渣加水2 000 mL依法再次煎煮30 min，合并 2 次煎出液，放置于50 ℃ 水浴鍋中緩慢蒸發，濃縮至500 mL（按生藥算，質量濃度相當于1 g·mL-1），冷藏于4 ℃冰箱備用。

23Cocktail探針法測定決明子水提液對大鼠肝臟CYP450酶活性水平的影響

231肝微粒體的制備各組大鼠給藥結束后，禁食12 h，脫臼處死，迅速打開腹腔和胸腔，用注射器以4 ℃生理鹽水由門靜脈灌洗，結扎上腔靜脈，灌洗至肝臟呈土黃色。將肝臟剪碎，按1∶4加入TMS緩沖液，冰浴中勻漿。勻漿液4 ℃，12 000×g離心20 min，棄沉淀。上清液4 ℃，105 000×g離心60 min，棄上清，沉淀部分即肝微粒體。按初始勻漿時每1 g肝組織加入1 mL TrisHCl儲存液（4 ℃），重懸微粒體，冰浴，玻璃勻漿器手動研磨，使微粒體均勻分散。分裝微粒體，-80 ℃保存。采用康為公司的BCA法測定肝微粒體蛋白濃度，按試劑盒說明書進行操作。

232肝微粒體孵育體系將肝微粒體與CYP450同工酶探針藥物共同孵育，測定探針藥物代謝產物的生成量來反映決明子水提液對CYP450同工酶的誘導或抑制作用。孵育體系包括肝微粒體（05 g·L-1），NADPH（1 mmol·L-1），CYP特異性探針底物非那西丁（10 μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol·L-1）、安非他酮（25 μmol·L-1）、右美沙芬（5 μmol·L-1）、氯唑沙宗（25 μmol·L-1）和咪達唑侖（25 μmol·L-1），K2HPO4/KH2PO4緩沖液（005 μmol·L-1，pH 74）補足體系至200 μL。37 ℃水浴預孵育5 min后加入同樣預孵育5 min的NADPH啟動反應，37 ℃水浴溫孵育30 min，加入200 μL預冷的終止劑（普萘洛爾100 μg·L-1，大黃素1 μmol·L-1，溶劑為甲醇乙腈1∶1）終止反應。混懸5 min后，4 ℃，13 000×g離心10 min，取上清液進樣定量分析各底物的代謝產物生成率，測得酶活性。

決明子水提液中、高劑量組可明顯誘導CYP1A2，2B1，2C11，2D2，2E1和3A1酶活性，在mRNA水平對CYP1A2，2C11，2D2，2E1 mRNA的表達具有顯著上調作用，因此選擇了CYP2C11，2E1進行蛋白表達分析。分析結果顯示決明子水提液僅對CYP2C11，2E1蛋白表達有誘導作用，見圖2。

4討論

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）又稱混合功能氧化酶和單加氧酶，為一類亞鐵血紅素硫醇鹽蛋白的超家族，是一種單鏈的B族細胞色素蛋白。在動物、植物、微生物的各種組織中廣泛存在，包括許多同工酶，是微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶，主要存在于成人肝臟中，在內源和外源化合物的代謝過程中有重要作用[9]。

中藥多組分和多靶點的特性決定了其作用機制的復雜性，對主要有效成分的酶活性評價可以為深入認識中藥合理應用及機制提供科學依據[10]。一般而言，酶抑制作用所致的代謝性相互作用的臨床意義遠大于酶促作用，約占該酶系統全部相互作用的70%。中藥有效成分對 CYP450酶的抑制能降低合用的其他中藥成分或化學藥物的體內代謝消除，打破合用藥物與其代謝產物之間的平衡，增高血藥濃度或引起蓄積，可能導致藥物的藥效增強乃至不良反應或毒性反應的發生。因此，評價中藥有效成分對 CYP450 酶活性的影響，對于臨床安全用藥、降低藥物藥物相互作用[11]的風險有重要的意義。

本文就從藥物代謝酶的角度，主要對CYP各亞型在酶活性、mRNA和蛋白水平的影響進行了研究和比較。本研究結果顯示，決明子水提液高劑量組對主要CYP酶的誘導作用最顯著，故初步推測決明子具有肝藥酶誘導作用，可與一些治療窗口比較窄、有明顯毒副作用的藥物合用，可加快其代謝反應，緩解臨床不良反應[12]。大鼠CYP1A2酶與人類CYP1A2酶同源，CYP1A2主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的13%，僅次于CYP3A和CYP2C亞家族，居肝臟各CYP酶含量的第3位[13]，臨床上，如茶堿、他克林、硝苯地平等多環芳烴類致癌物以及咪唑喹啉派生物等20多種藥物經CYP1A2酶代謝，決明子可以誘導CYP1A2的酶活性，加快藥物的代謝導致藥效降低，因此應注意決明子與這些藥物之間可能的相互作用，尤其是對于治療窗窄的藥物，比如茶堿類，更應注意使用劑量。大鼠CYP2B1酶與人類CYP2B6酶同源，CYP2B6參與代謝的臨床藥物如氯氨酮、非核苷類的逆轉錄酶抑制劑依法韋侖等[14]，決明子誘導CYP2B6酶活性，能使某些藥物（代謝產物無活性）藥效降低，或產生耐藥；而另一些藥物（代謝產物有活性）在常規劑量下導致中毒。大鼠CYP2C11酶與人類CYP2C9酶同源，臨床上經CYP2C9酶代謝的藥物有塞來考希昔、格列吡嗪、華法林等，當決明子與CYP2C9的底物合用時[15]，這些底物在體內代謝速率可能會加快，其中華法林是現在臨床上使用最廣泛的抗凝血藥，治療窗窄，決明子可能會使華法林血藥濃度降低，造成凝血危險，因此在使用過程中應注意觀察，合理使用安全劑量。大鼠CYP2D2酶與人類CYP2D6同源，CYP2D6含量雖比其他 CYP450 亞家族低，但參與了市場上20%～25%臨床藥物的代謝，包括精神安定藥、抗心律失常藥、鎮痛藥、抗抑郁藥、止吐藥以及一些抗癌藥等[16]，臨床上經CYP2D6酶代謝的藥物有丙咪嗪、多柔比星、地塞米松等，推測決明子有可能加速這些藥物的體內代謝。大鼠CYP2E1酶與人類CYP2E1同源，并且有很好的相關性，CYP2E1是一種非常重要的CYP450酶，它不僅參與了藥物代謝，而且能夠催化許多前致癌物質和前毒物轉化為致癌物質和有毒物質，還可催化大量的普通毒物的代謝，其中包括氯化的小分子有機化合物如四氯化碳、乙醇類、乙酰氨基苯等，決明子誘導CYP2E1可能會與CYP2E1前毒物類底物產生不利的藥物相互作用，誘導前毒物轉化為毒性物質，加大不良反應的發生幾率；決明子也可能會加速經CYP2E1代謝的有毒藥物的代謝，生成沒有毒性的代謝產物[17]。大鼠CYP3A1酶與人類CYP3A4同源，臨床上經CYP3A4酶代謝的藥物有阿托伐他汀、辛伐他汀、地高辛等，CYP3A4主要存在于人類的肝臟及腸道中，其中它在肝臟中占P450酶總量的25%左右，臨床中約有50%的藥物經由CYP3A4酶代謝，CYP3A4為辛伐他汀的主要代謝酶之一，在調節血脂過程中，決明子可能會加速辛伐他汀的體內代謝，應進行調整藥物用量，在藥效最大的同時將不良反應降到最低限[18]。

決明子作為一種常用的中藥材，臨床上常與枸杞子、桑葚、紅花、山楂等中藥配伍，當患者長期服用含有決明子的中成藥和復方時，應考慮到臨床上可能潛在的藥物相互作用，所以下一步研究會重點關注決明子與上述中藥配伍使用產生的相互作用，從整體去闡述其在機體內的變化。決明子水提液對大鼠CYP450酶的研究表明，其臨床劑量對CYP450酶的整體影響較小，高劑量主要表現為誘導作用，臨床代謝性相互作用上屬于相對安全的藥物，這與其被列入既是藥品又是食品的物品相符。本實驗優化決明子給藥方案，能為合理選用同類藥品提供依據，避免具有臨床意義的藥物代謝性相互作用的發生，從而提高臨床用藥的有效性和安全性。此外，體外實驗不能全面的反應體內實驗和臨床實驗的結果。因此研究中藥藥理作用的分子機制，中藥間及中西藥間相互作用的機制、解釋中藥合理應用的科學內涵還要進行更加深入的研究[19]。由于CYP450存在一定的種屬差異性，雖然大鼠的CYP450亞型與人的接近程度較高，但并不能代替人的所有CYP450亞型代謝模式，因此，研究決明子對人體CYP450亞型酶活性的作用，仍需進一步的人體試驗。

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[責任編輯馬超一]