薄荷油與薄荷醇促進中藥成分經皮吸收的對比研究

蘭頤 王景雁 陶野 茹慶國 王逸飛 于競新 劉艷 吳清

[摘要]該文擬探討并比較薄荷油與薄荷醇對中藥復雜成分的經皮促透作用特征規律。選擇系列不同logP（油水分配系數）中藥有效成分作為模型藥物，即蛇床子素（logP=385）、川芎嗪（logP=234）、阿魏酸（logP=126）、葛根素（logP=-035）、京尼平苷（logP=-101），簡化并表征中藥復雜成分體系，采用體外透皮試驗，對比分析薄荷油與薄荷醇的經皮促透作用特征。同時，采用傅利葉變換紅外光譜（FTIR）技術進一步比較薄荷油與薄荷醇對皮膚角質層內在分子結構的影響。研究結果顯示，適宜濃度的薄荷油與薄荷醇均可促進不同logP藥物成分的經皮吸收，薄荷醇作用下藥物經皮促透倍數對數值與藥物logP向于負線性關系，薄荷油作用趨向于呈拋物線關系，但都表現出對logP較低藥物（即親水性藥物）具更佳的經皮促透效果，其作用趨勢相似。紅外光譜研究顯示，薄荷油與薄荷醇主要通過影響角質層脂質而影響皮膚屏障功能，且作用強度相近，與體外透皮試驗結果一致。可知，薄荷油與薄荷醇的體外經皮促透作用特征相似，且對角質層內在分子結構影響相同，因此，作為經皮促透劑應用條件下，可以考慮選擇成分單一的薄荷醇代替組成復雜的薄荷油。

[關鍵詞]薄荷油；薄荷醇；經皮促透劑；經皮吸收；傅利葉變換紅外光譜

[Abstract]The aim of this paper was to investigate and compare the penetrationenhancing characteristics of menthol and essential oil from Mentha haplocalyx（Mhaplocalyx oil） on the transdermal absorption of the complex traditional Chinese medicine（TCM） components A series of TCM components were selected as model drugs based on their lipophilicity （logP value）， namely osthole（OT， logP=385）， tetramethylpyrazine（TMP， logP=234）， ferulic acid（FA， logP=126）， puerarin（PR， logP=-035） and geniposide（GP， logP=-101）， in order to simply and characterize the TCM complex components system Transdermal experiment in vitro was employed to investigate and compare the penetrationenhancing characteristics of menthol and Mhaplocalyx oil on the transdermal absorption of these model drugs Meanwhile， Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR） was used to further compare the effect of menthol and M haplocalyx oil on the molecular structure of stratum corneum（SC） The results showed that both of menthol and Mhaplocalyx oil at proper concentration could promote the transdermal absorption of the selected model drugs After application of menthol， the drug logP values gradually tended to have negative linear relationship with the logarithm of penetration enhancement ratio（ER）； while after application of Mhaplocalyx oil， the logP values tended to have parabolic relationship with the logarithm of ER However， both menthol and Mhaplocalyx oil exhibited higher efficiency for the drugs with relative low lgP value（ie hydrophilic drugs）， with similar penetrationenhancing characteristics between these two Infrared spectroscopy results showed that menthol and Mhaplocalyx oil could affect the skin barrier functions mainly via stratum corneum lipids， with similar effect intensity， and this was consistent with the results of transdermal experiment in vitro Thus， Menthol had similar penetrationenhancing characteristics with Mhaplocalyx oil， and had same effect on the SC molecular structure Therefore， as transdermal penetration enhancer， the menthol with single composition could be considered to replace Mhaplocalyx oil with complex compositions

[Key words]essential oil from Mentha haplocalyx； menthol； transdermal penetration enhancer； transdermal absorption； FTIR

doi：10.4268/cjcmm20160825

薄荷為唇形科多年生草本植物薄荷Mentha haplocalyx Briq的莖葉，在中藥外用制劑中應用廣泛，多利用其“芳香走竄”特性而發揮“率領群藥、直達病所”之功，具有類似現代經皮促透劑的作用。薄荷的有效部位主要為其揮發油成分，因此，薄荷油作為促透劑成為目前研究的熱點，文獻研究也顯示[12]，薄荷油作為促透劑可促進某些成分的經皮吸收，如L肉堿、左旋延胡索乙素等。其中，薄荷醇是薄荷油中含量最高的一種成分，一般約占50%以上[3]，文獻研究顯示，薄荷醇作為促透劑也具有良好的經皮促透效果[45]。

但是，薄荷油與薄荷醇的經皮促透研究多集中在對某單一成分的促透評價，對中藥復雜成分的經皮促透特征目前尚不清楚，同時，薄荷醇作為薄荷油中最主要成分，是否可用成分單一的薄荷醇代替組成復雜的薄荷油用于中藥外用制劑的經皮促透，有待進一步研究。因此，本文基于現代經皮定量結構滲透性關系（quantitative structurepermeation relationships， QSPRs）研究結果，即藥物理化性質中logP（油水分配系統）是影響藥物經皮吸收最主要的影響因素[67]。因此，選擇系統不同logP有效成分簡化并表征復雜中藥成分體系，即蛇床子素（osthole， OT，logP=385）、川芎嗪（tetramethylpyrazine， TMP，logP=234）、阿魏酸（ferulic acid， FA，logP=126）、葛根素（puerarin， PR，logP=-035）、京尼平苷（geniposide，GP，logP=-101），通過測定其經皮促透作用情況，對比探討薄荷油與薄荷醇的經皮促透作用特征。同時，采用傅利葉變換紅外光譜技術（FTIR）進一步比較薄荷油與薄荷醇對角質層內在分子結構的影響，從而為其在中藥外用制劑中的合理應用提供科學指導。

1材料

TK20B型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；島津高效液相色譜系統（包括LC20AT泵、SPD20A紫外檢測器，日本島津公司）；Nexus型全反射傅利葉變換紅外光譜儀（ATRFTIR，美國ThermoNicolet公司）；Sartorius BS 110型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；CP7800型電動遞毛器（科德士電器有限公司）。

薄荷藥材購于北京本草方源藥業有限公司，批號20131007，產地江蘇，經北京中醫藥大學中藥炮制系譚鵬副教授鑒定為唇形科植物薄荷M haplocalyx的干燥地上部分，符合《中國藥典》（2010年版）相應項標準。薄荷油采用2010年版《中國藥典》附錄揮發油提取甲法提取，得淡黃色油狀液體，無水硫酸鈉脫水后避光密閉保存。GCMS測定其主要成分為薄荷醇（menthol， 5100%）、薄荷酮（menthone， 611%）、瓜菊醇酮（cinerolone， 319%）、優香芹酮（eucarvone， 258%）、胡椒酮（piperitone， 219%）、異薄荷酮（isomenthone， 199%）、長葉薄荷酮（pulegone， 132%）等[8]。

薄荷醇、阿魏酸（純度>9800%）均購于國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為F20110811，20120328；川芎嗪購于SigmaAldrich公司，批號為14003DEV；蛇床子素、葛根素、京尼平苷均購于NCE Biomedical公司，純度均>9800%，批號分別為20131209，20131209，20131209；芐澤98（Brij 98）購于SigmaAldrich公司，批號為MKBP0994V；丙二醇購于SigmaAldrich公司，批號為WXBB1075V；冰醋酸購于北京化工廠，批號為20080103；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

健康雄性SD大鼠，5周齡，體重約（200±10） g，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011004。

2方法

21模型藥物HPLC法的建立

分別配制各模型藥物對照品的對照液、體外透皮試驗空白接收液及含藥體外透皮試驗接收液，考查各方法專屬性、線性關系、精密度及相對回收率，見表1。結果顯示，接受液中其他成分對各模型藥物的測定均無干擾，其中，蛇床子素在001～100 mg·L-1線性關系良好，低、中、高3個質量濃度（01，10，50 mg·L-1）的日內精密度分別為029%，0060%，014%，日間精密度分別為18%，013%，019%，相對回收率分別為9563%，1006%，1001%；川芎嗪在01～400 mg·L-1線性關系良好，低、中、高3個質量濃度（1，20，200 mg·L-1）的日內精密度分別為035%，012%，020%，日間精密度分別為24%，25%，27%，相對回收率分別為9559%，9580%，9761%；阿魏酸在01～200 mg·L-1線性關系良好，低、中、高3個質量濃度（1，20，100 mg·L-1）的日內精密度分別為038%，021%，025%，日間精密度分別為18%，015%，014%，相對回收率分別為9172%，9074%，9524%；葛根素在01～400 mg·L-1線性關系良好，低、中、高3個質量濃度（1，20，200 mg·L-1）的日內精密度分別為048%，032%，026%，日間精密度分別為022%，0070%，0050%，相對回收率分別為9748%，9774%，9927%；京尼平苷在01～400 mg·L-1線性關系良好，低、中、高3個質量濃度（1，20，200 mg·L-1）的日內精密度分別為079%，072%，12%，日間精密度分別為17%，23%，12%，相對回收率分別為9641%，9784%，9959%。

22體外經皮滲透試驗

221離體鼠皮的制備在體外經皮滲透實驗前，取雄性SD大鼠斷頸處死，用剃毛器小心剃去腹部鼠毛后剝離其腹部皮膚，在玻璃板上小心剔除皮下脂肪組織和黏連物，然后用磷酸緩沖液（PBS）清洗干凈，待用。

222供給液的制備為求算薄荷醇和薄荷油的經皮透滲穩態流速、滯后時間，采用無限給藥技術進行體外透皮實驗。故供給池中藥液的配制方法為：將足量的模型藥物分別溶于丙二醇水（80∶20）混合溶劑系統中，加入相應濃度薄荷醇或薄荷油，渦旋5 min，超聲15 min使其充分溶解。

223體外透皮試驗將剝離的大鼠腹皮固定于FranZ擴散池之間（擴散池有效擴散面積為177 cm2，接收池體積為7 mL），皮膚角質層面朝向供給池，真皮層面朝向接收池。在加入供給液前平衡約05 h，供給池加入供給液2 mL，然后封口膜封住供給池口防止水分蒸發；接收池中蛇床子素透皮接收液選擇3% Brij98 PBS為接收液，其他藥物均以001 mol PBS溶液（pH 72）為接收液[14]。溫度設置為（32±03） ℃，接收池攪拌子轉速為300 r·min-1。在1，2，4，6，8，10，12，22，24 h分別取樣1 mL，然后向接收池中補加相同體積新鮮接受液，所得樣品過濾后，按照建立的方法測定藥物含量。

23衰減全反射傅利葉變換紅外光譜（ATRFTIR）研究

將制得的大鼠腹皮置于04%胰蛋白酶溶液中，室溫放置約10 h，然后用棉簽小心分離皮膚角質層，取得的角質層片用蒸餾水洗清干凈，置于真空干燥箱干燥，備用。

取大小適宜（1 cm×1 cm）的干燥角質層片，分別置于10 mL離心管內。試驗分為空白組（Blank組，不做任何處理）、對照組[Control組，丙二醇水（20∶80）溶劑處理]、薄荷醇組和薄荷油處理組（配制方法同透皮試驗揮發油）。分別取干燥角質層片置于約5 mL各組對應促透劑溶液中，室溫條件下處理12 h后，用蒸餾水清洗掉角質層片上殘留溶劑，放置于真空干燥箱37 ℃脫水干燥。干燥后的角質層片采用衰減全反射傅利葉變換紅外光譜進行掃描測定，儀器參數設置為：分辨率2 cm-1；掃描次數為100；掃描范圍為650～4 000 cm-1。

24透皮數據處理及統計分析

根據藥物單位面積累積透過量與時間作圖得到藥物經皮滲透動力學曲線，各藥物的累積透過量可按下式計算。

Q=（Cn×V+∑n-1i=1Ci×Vi）/A

其中，Q（μg·cm-2）為單位面積累積透過量，V為擴散池的體積（7 mL），Vi為每次取樣體積，Cn和Ci分別為第n次和第i次取樣時接收液中藥物濃度，A為擴散面積（177 cm2）。以累積透過量對時間作圖，所得直線部分（6～12 h）的斜率即為穩態透皮速率（Jss，μg·cm-2·h-1），直線部分反向延長線與X軸的交點即為滯后時間（Tlag，h）。為進一步比較促透劑的促滲效果，按下列公式計算其經皮促滲倍數：ER（enhancement ratio）=Jss（含促透劑）/Jss（不含促透劑）；實驗數據以±s表示，以SPSS 160軟件進行數據統計分析，組間比較采用t檢驗，P<005為差異有統計學意義。

3結果

31促透劑對模型藥物的經皮促透作用情況

薄荷醇與薄荷油對各模型藥物滲透過大鼠皮膚的體外滲透動力學曲線及相關經皮滲透參數的影響分別見圖1，表2。由圖表可知，除個別模型藥物外，1%薄荷醇和薄荷油對各模型藥物的經皮滲透參數（如體外穩態經皮速率、累積透過量等）沒有顯著影響，而隨著促透劑濃度的增加，對各模型藥物的經皮滲透速率增加明顯，并表現出顯著性差異（P<005），表明薄荷醇與薄荷油對不同lgP藥物經皮滲透的影響呈現出濃度依賴性關系。其中，5%薄荷醇對蛇床子素、川芎嗪、阿魏酸、葛根素及京尼平苷的增透倍數分別為368，2433，14748，2 22660，1 74950；5%薄荷油對蛇床子素、川芎嗪、阿魏酸、葛根素及京尼平苷的增透倍數分別為803，1514，20690，3 31300，80960。同時，在薄荷醇和薄荷油作用下，各模型藥物經皮滲透的滯后時間（Tlag）逐漸延長，并隨促透劑濃度的增加表現出顯著性差異（P<005）。該研究結果顯示，適宜濃度的薄荷醇與薄荷油均可促進不同lgP藥物有效成分的經皮吸收。

32不同logP模型藥物與其促透倍數的相關性

將不同濃度薄荷醇和薄荷油作用下各模型藥物經皮促透倍數的對數值與對應藥物logP進行關聯分析，見圖2。在薄荷醇作用下，模型藥物經皮促透倍數對數值與藥物logP趨向于負線性關系，其中1%薄荷醇作用下的關系式為lgER=-004logP+018（r=0413 6）；3%薄荷醇作用下的關系式為lgER=-034logP+152（r=0903 2）；5%薄荷醇作用下的關系式為lgER=-059logP+287（r=0988 1）。由于1%薄荷醇作用下的經皮促透作用相對較弱，其促透倍數未表現出顯著性差異，故該濃度薄荷醇作用下并未表現出較明顯的關系。而隨著薄荷醇應用濃度的增加，促透倍數對數值與藥物logP逐漸呈負線性相關，表明適宜濃度薄荷醇作用下對logP越低的有效成分（即親水性較強成分）的經皮促透倍數越高。值得注意的是，雖然相關性分析結果顯示隨著薄荷醇應用的增加，藥物logP與促透倍數對數值表現出較明顯的負線性相關，但3%和5%薄荷醇對京尼平苷的促透倍數均低于其對葛根素的促透倍數（圖2），也提示當藥物logP低于某值后（估計logP約為-1～-05），薄荷醇的經皮促透作用開始逐漸下降，但該結論需選擇更多該區間內藥物進行測定以進一步證實。

在薄荷油作用下，模型藥物經皮促透倍數對數值與藥物logP趨向于呈拋物線關系式，其中，3%薄荷油作用下為：lgER=-0055 7logP2+0075logP+0729 2（r=0554 0）；5%薄荷油作用下為：lgER=-0016 6logP2-0480 6logP+2827 9（r=0931 8）；由于1%薄荷油未表現出明顯的促透作用，因此1%薄荷油也未表現出明確的作用關系。該結果也提示薄荷油作用下，對不同logP藥物成分的經皮促透作用特點表現為：藥物經皮促透倍數隨logP降低而增加，但當logP降到某值后，則開始表現出隨logP降低而降低，表明薄荷油對適宜親水性藥物（logP估計值約為-050）具有最佳促透效果。

由上述結果可知，雖然薄荷醇作用下藥物經皮促透倍數對數值與藥物logP趨向于負線性關系，而薄荷油趨向于呈拋物線關系，但都表現出對logP較低藥物（即親水性藥物）具更佳的經皮促透效果，其作用趨勢相似。

33FTIR分析

角質層這種特殊的“磚墻”結構決定了角質層是藥物經皮吸收的主要限速過程，其主要成分為脂質與角蛋白，且其脂質在藥物經皮吸收屏障中發揮主要作用[1516]。由于FTIR可以獲取角質層脂質和角蛋白次級結構吸收峰信息，因此利用該技術可判斷角質層分子結構的變化情況。正常大鼠皮膚角質層紅外吸收光譜峰（圖3Blank組）的歸屬如下：脂質特征吸收峰約為2 917 cm-1，為脂質CH不對稱振動吸收峰（νas），2 849 cm-1為脂質CH對稱振動吸收峰（νs）；角蛋白特征吸收峰約為1 652，1 538 cm-1，當這些物質吸收振動峰位發生移動，則表明其結構發生了一定改變[1718]。根據體外透皮試驗結果，選擇有適宜促透效果的促透劑進行紅外光譜分析，因此，選擇3%薄荷油與薄荷醇比較其對皮膚角質層分子結構的影響。

薄荷醇與薄荷油作用于角質層后相應脂質和角蛋白的紅外光譜圖和吸收峰位移變化情況中，見表3，由圖表數據可知，未經處理的大鼠角質層（Blank組）與經PGH2O（80∶20）混合溶劑處理的對照組相比，脂質碳氫振動峰和角蛋白吸收峰沒有明顯移動，表明該溶劑系統對皮膚結構沒有顯著影響，與前期文獻報道相一致[18]。而在薄荷油和薄荷醇作用下，脂質碳氫不對稱振動吸收峰（νas）和對稱振動吸收峰（νs）分別向右移動271，296 cm-1和085，161 cm-1，而對角蛋白酰胺吸收峰沒有明顯影響，表明薄荷油和薄荷醇主要通過影響角質層脂質而影響皮膚屏障作用，且兩者對角質層分子結構的影響相同，這與體外透皮試驗結果也相一致。

4討論

藥物理化性質或結構特征通常直接決定了其生物活性，國內外許多研究進行了大量經皮定量結構滲透性關系研究（QSPRs），擬將化合物的皮膚通透性與其理化性質（如lgP，相對分子質量，酸堿性等）或結構特征用統計學方法聯系起來。其中，Pottst Guy等提出了較為經典也是文獻引用最多的QSPRs模型，即lgKp=-63+071×lgP-0006 1×MW，（lgKp為人體皮膚通透系數，lgP為辛醇水分配系數的對數值，MW為藥物相對分子質量）。其他QSPRs研究結果也顯示，藥物皮膚通透性（以經皮速率或通透系數表示）與藥物的lgP具有最為密切的相關關系。因此，本研究選擇系列較大范圍內不同lgP有效成分來簡化并表征復雜成分體系，以對比研究薄荷油和薄荷醇作為促透劑的經皮促透作用特征。

在體外透皮試驗供給液的選擇中，本實驗選擇丙二醇水 80∶20混合溶劑系統，主要是基于以下2個方面的考慮，首先，該混合溶劑系統可溶解較大極性范圍的藥物，由于本研究所選擇的模型藥物極性大小不同，使用該溶劑系統可保證在同一供給液條件下進行體外評價，確保體外透皮試驗的均一性。其次，丙二醇水 80∶20溶劑系統對皮膚影響較小，不會改變皮膚的正常生理結構[19]。

該實驗研究顯示，雖然薄荷醇作用下藥物經皮促透倍數對數值與藥物lgP趨向于負線性關系，而薄荷油的作用趨向于拋物線關系，但兩者的經皮促透作用強度和趨勢相似。紅外光譜研究結果也顯示，薄荷醇與薄荷油對皮膚角質層分子結構的影響也大致相同。同時，考慮到薄荷油在實際提取過程中出油率相對較低，該揮發油的獲得成本較高，且成分比例難以有效控制，而薄荷醇目前已可通過化學合成獲得，成本較低，且為純度較高的單體成分，易于質量控制。因此，該研究結果提示，作為經皮促透劑應用條件下，可考慮選擇成分單一也易于控制的薄荷醇代替組成復雜的薄荷油。

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[責任編輯曹陽陽]