雪上一枝蒿總堿凝膠中雪甲素經(jīng)皮藥動學(xué)研究

吳玉梅 陳曉蘭 劉文 楊芳芳 唐紅艷 戴雅潔

[摘要]該研究結(jié)合UPLCMS/MS聯(lián)用技術(shù)，比較雪上一枝蒿總堿凝膠和雪上一枝蒿總堿微乳凝膠中雪上一枝蒿甲素（雪甲素）在小鼠皮膚、血液中的藥物濃度隨時間的變化過程，并對其藥代動力學(xué)參數(shù)進行比較分析。以探討微乳制劑在透皮給藥制劑中可行性。該試驗建立UPLCMS/MS同時測定血漿和皮膚中雪甲素的方法，靈敏度高，符合透皮給藥藥動學(xué)研究要求。微乳凝膠通過皮膚進入血液的主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax為（3762±1431） μg·L-1，Tmax為（340±134） h，AUC0∞為（1 0277±260） μg·L-1·h-1，MRT為（3480±1231） h，MRTlast為（1068±057） h，t1/2為（2311±920） h；普通凝膠通過皮膚進入血液的主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax為（5223±1590） μg·L-1，Tmax為（400±000） h，AUC0∞為（72860±28080） μg·L-1·h-1，MRT為（2069±398） h，MRTlast為（934±042） h，t1/2為（1469±315） h。結(jié)果表明，微乳凝膠較普通凝膠透皮吸收較平穩(wěn)，作用時間長，生物利用度高，顯示微乳凝膠具有良好而穩(wěn)定的透皮效果。微乳凝膠和普通凝膠中雪甲素在皮膚中的生物利用度差異不明顯。

[關(guān)鍵詞]雪上一枝蒿總堿；微乳凝膠；普通凝膠；藥動學(xué)

[Abstract]In this study， the changes of bullatine A in plasma and skin of mice with time in microemulsion gel and ordinary gel of Aconitum brachypodum total alkaloids were compared through UPLCMS/MS， and their pharmacokinetic parameters were also compared and analyzed， to investigate the feasibility of microemulsion agent in the transdermal drug delivery UPLCMS/MS method for simultaneous determination of bullatine A in plasma and skin had high sensitivity and was in line with the pharmacokinetic study requirements for transdermal drug delivery The main pharmacokinetic parameters for microemulsion gel in the plasma were as follows： Cmax=（3762±1431） μg·L-1， Tmax=（340±134） h， AUC0∞=（1 0277±260） μg·L-1·h-1， MRT=（3480±1231） h， MRTlast=（1068±057） h， t1/2=（2311±920） h； main pharmacokinetic parameters for ordinary gel in the blood： Cmax=（5223±1590） μg·L-1， Tmax=（400±000） h， AUC0∞=（72860±28080） μg·L-1·h-1， MRT=（2069±398） h， MRTlast=（934±042） h， t1/2=（1469±315） h The results showed that the microemulsion gel had more stable transdermal absorption， longer duration of action and higher bioavailability than ordinary gel， indicating that the microemulsion gel had a good and stable transdermal effect There was no significant difference in bioavailability of bullatine A in skin between microemulsion gel and ordinary gel

[Key words]Aconitum brachypodum total alkaloids； microemulsion gel； ordinary gel； pharmacokinetic

doi：10.4268/cjcmm20160827

雪上一枝蒿性溫，味苦、辛，有大毒，有祛風(fēng)除濕、通利關(guān)節(jié)、消腫止痛的功效。其生物堿類成分是其有毒成分且具有活血、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[12] 。 雪甲素是雪上一枝蒿的主要成分之一，屬于二萜類生物堿。現(xiàn)代藥理實驗研究表明具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜的功效。微乳作為載體透皮給藥，與其他劑型相比具有獨特優(yōu)勢，能提高藥物的透皮能力，可在角質(zhì)層和真皮形成藥物儲庫，明顯緩釋藥物，達(dá)到長時間高劑量的釋放[3]，從而提高藥物的生物利用度，達(dá)到增效減毒的目的。 在前期工作中，本團隊完成了雪上一枝蒿微乳的研制[4]。但由于微乳黏度低，導(dǎo)致微乳直接涂抹于動物皮膚上時容易流失，造成給藥劑量不準(zhǔn)確等。因此，本試驗將雪上一枝蒿微乳制備成微乳凝膠，在此基礎(chǔ)上本文建立了經(jīng)皮給藥后大鼠血和皮膚中雪甲素的UPLCMS/MS含量測定方法，考察了雪上一枝蒿總堿凝膠和微乳凝膠經(jīng)皮給藥后不同時間點雪上一枝蒿甲素在皮膚及血藥中的濃度，并計算相應(yīng)的藥代動力學(xué)參數(shù)，為雪上一枝蒿經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的新制劑開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1材料

UPLCTQD三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters）；TYXHⅡ型渦旋混合器（無錫沃信儀器有限公司）；HC2062型高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；MTN2800型氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；AE/240型電子天平（上海梅特勒儀器有限公司）。

色譜純乙腈、甲醇（Merck公司）；雪上一枝蒿總堿微乳凝膠（自制，批號20150810）；雪上一枝蒿總堿普通凝膠（自制，批號20150810）；雪上一枝蒿甲素（純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院，批號110895200404）；鹽酸帕羅西汀（純度為974%，中國食品藥品檢定研究院，批號100357201303）；甲酸（CNY Technologies）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析級。

昆明種小鼠80只，雄性，體重18～22 g，清潔級，由重慶滕鑫生物有限公司提供，合格證號SCXK（渝）20120003。

2方法

21血漿與皮膚中雪甲素濃度的UPLCMS/MS檢測方法

211色譜條件

Waters BEH C18色譜柱（21 mm×50 mm，17 μm）；流動相02%甲酸水（A）02%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，15%～50% B，2～3 min，50%～15% B，4～5 min，15% B，流速03 mL·min-1；進樣體積為1 μL，柱溫45 ℃。

212質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI）；毛細(xì)管電離電壓3 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑氣溫度550 ℃；噴霧氣與反吹氣為氮氣，去溶劑氣流速650 L·h-1，反吹氣流速50 L·h-1；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)控離子模式（MRM），用于定量分析監(jiān)測的離子對反應(yīng)為：m/z 344→580（雪甲素）和m/z 330→192（鹽酸帕羅西汀）；錐孔電壓為54 V；碰撞能量為50 eV。

22樣品制備

221血樣處理

將小鼠背部用脫毛膏脫毛（15 cm×25 cm），生理鹽水洗凈，在其脫毛處給以雪上一枝蒿總堿凝膠或微乳凝膠03 g，摘眼球取血，于4 000 r·min-1離心10 min，取血漿200 μL，加入10 μL質(zhì)量濃度為440 μg·L-1的鹽酸帕羅西汀內(nèi)標(biāo)溶液，加入乙腈590 μL[5]，渦旋混合1 min，1萬 r·min-1離心10 min，取上清液600 μL氮氣吹干，加入50%乙腈[6]100 μL復(fù)溶，渦旋混合1 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣。

222皮膚處理

取完血后，將小鼠脫頸處死。先用干棉花將背部剩余的藥擦掉，再用蘸有生理鹽水的棉花擦拭皮膚，用干棉花擦拭，重復(fù)擦拭3次，剪下給藥處皮膚。將皮膚剪碎，加入1 mL 50%乙腈，渦旋混合3 min，勻漿，渦旋混合3 min，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液500 μL，加入10 μL質(zhì)量濃度為44 mg·L-1的鹽酸帕羅西汀內(nèi)標(biāo)液，加入50%乙腈490 μL，渦旋混合3 min，1萬 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)022 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進樣。

23方法可行性考察

231色譜考察

按照擬定的色譜條件，將221中的空白樣品、供試品血漿和制備的對照溶液（含雪甲素50 mg·L-1和鹽酸帕羅西汀50 mg·L-1）分別進樣，結(jié)果見圖1。雪甲素、鹽酸帕羅西汀與血漿中的其他成分分離良好，其保留時間分別為077，25 min，空白血漿中與雪甲素、鹽酸帕羅西汀相應(yīng)的時間處無雜質(zhì)峰。

232雪甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取質(zhì)量濃度為58，116，290，580，1 160，2 900，5 800 μg·L-1的雪甲素對照品溶液10 μL，加入200 μL空白血漿，使其含雪甲素為29，58，145，29，58，145，290 μg·L-1，按221項下處理后，分別測定雪甲素和鹽酸帕羅西汀的峰面積。以雪甲素濃度為橫坐標(biāo)，雪甲素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，進行回歸處理，平行制備3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，得平均的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0011X-0048，r=0999 5。

取質(zhì)量濃度為1078，2156，539，1078，2156，539，8624 mg·L-1的雪甲素對照品溶液10 μL，加入500 μL空白皮膚勻漿液，使其含雪甲素為0215 6，0431 2，1078，2156，4312，1078，17248 mg·L-1，按222項下處理后，分別測定雪甲素和鹽酸帕羅西汀的峰面積。以雪甲素濃度為橫坐標(biāo)，雪甲素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，進行回歸處理，平行制備3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，得平均的回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0202X+0115，r=0999 5。

233回收率測定

2331血漿回收率測定向空白血漿中加入一定量的雪甲素對照溶液，分別制得含雪甲素58，29，232 μg·L-1的血漿溶液（n=5）。按221方法處理，UPLCMS/MS測定峰面積比值和該濃度對照品50%乙腈溶液峰面積比值，分別得提取回收率為（8673±692）%（8647±215）%，（8534±240）%。

將上述含雪甲素58，29，232 μg·L-1的血漿處理溶液（n=5）所測定的峰面積比值分別與該濃度對照品用同法制備的血漿處理溶液（n=5）的峰面積比值比較，分別得方法回收率為（9323±977）%，（10578±423）%，（10196±1011）%。

2332皮膚回收率測定向空白皮膚勻漿液中加入一定量的雪甲素對照品溶液，分別制得含雪甲素0431 2，2156，17248 mg·L-1的皮膚溶液。按222方法處理，UPLCMS/MS測定峰面積比值與該濃度對照品50%乙腈溶液峰面積比值比較，分別得提取回收率為 （8995±893）%，（8480±234）%，（9592±187）%。

將上述含雪甲素0431 2，2156，17248 mg·L-1的皮膚處理溶液（n=5），所測定的峰面積分別與該濃度對照品用同法制備的皮膚處理溶液（n=5）的峰面積比較，分別得方法回收率為（9739±170）%，（11252±347）%，（9832±212）%。

234精密度測定

以2331方法，制得含雪甲素58，29，232 μg·L-13種質(zhì)量濃度的血漿溶液（n=5），測定日內(nèi)精密度RSD分別為80%，62%，99%；日間精密度RSD分別為10%，82%，96%。

以2332方法，制得含雪甲素0431，2156，17248 mg·L-13種質(zhì)量濃度的皮膚溶液（n=5），測定日內(nèi)精密度RSD分別為39%，28%，21%；日間精密度RSD分別為46%，31%，47%。

235穩(wěn)定性考察

配制含雪甲素高（232 μg·L-1）、中（29 μg·L-1）、低（58 μg·L-1）3個質(zhì)量濃度的血漿對照液以及高（17248 mg·L-1）、中（2156 mg·L-1）、低（0431 mg·L-1）3個質(zhì)量濃度的皮膚勻漿液各15份（每項實驗n=5），分別按血漿樣品處理項下和皮膚勻漿項下操作，考察室溫放置6 h和凍融3次的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，室溫下雪甲素血藥濃度變化RSD分別為92%，20%，47%；雪甲素在皮膚勻漿液中濃度變化RSD分別為31%，37%，41%；雪甲素血藥濃度變化RSD分別為11%，95%，94%；雪甲素在皮膚勻漿液中濃度變化RSD為10%，93%，10%。上述測定結(jié)果表明，雪甲素血漿樣品及皮膚勻漿液樣品各項穩(wěn)定性試驗結(jié)果均符合要求。

24實驗分組

取雄性SPF小鼠80只，體重18～22 g，隨機分為2組，分為雪上一枝蒿總堿微乳凝膠組（Ⅰ）和普通凝膠組（Ⅱ），每組40只，于實驗前12 h禁食，自由飲水。將小鼠背部用脫毛膏脫毛，生理鹽水洗凈，分別稱取03 g微乳凝膠或普通水凝膠（含雪上一枝蒿總堿510 mg和雪甲素0561 mg）緊貼于小鼠背部。給藥后，分別于05，1，2，4，6，8，12，24 h摘取眼球取血，每個時間點各5只小鼠。按照221項下處理脫頸處死，取皮膚后，-20 ℃保存，備用。

25數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以±s表示，用Kinetica 44軟件進行統(tǒng)計分析。

3結(jié)果

31小鼠血漿中雪甲素濃度的測定

按221項下處理血樣后，取1 μL進樣，UPLCMS/MS測定其中雪甲素濃度，平均藥時曲線見圖2。

32小鼠皮膚中雪甲素濃度的測定

按222項下方法處理皮膚，取1 μL進行UPLCMS/MS測定其中雪甲素濃度，平均藥時曲線見圖3。

33小鼠藥動學(xué)參數(shù)和皮膚分布

用Kinetica 44軟件處理雪甲素在血漿和皮膚

中濃度數(shù)據(jù)，經(jīng)自動擬合，小鼠經(jīng)皮給藥符合非房室模型。相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見表1，2。

4結(jié)論

本研究結(jié)合文獻[6]優(yōu)化出了一種檢測血漿和皮膚中雪甲素的UPLCMS/MS法，在處理和測定過程中，選擇了鹽酸帕羅西汀作為內(nèi)標(biāo)物，減少了操作和測定可能帶來的誤差。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)微乳和溶液直接給藥時，藥液會流失，造成給藥劑量不準(zhǔn)確。因此，本試驗將微乳和溶液加入適量黃原膠，制備成適合給藥的凝膠，通過透射電子顯微鏡和激光粒度測定儀測定，發(fā)現(xiàn)微乳在凝膠中仍為微乳，凝膠基質(zhì)并不影響其形態(tài)與粒徑，其工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究另文報道。

由表1和圖2可以看出，雪上一枝蒿總堿微乳凝膠經(jīng)皮給藥，血液中雪甲素達(dá)峰時間（34 h）較普通凝膠組（40 h）快，MRT大于普通凝膠組，藥時曲線下面積明顯高于普通凝膠組，但Cmax明顯低于普通凝膠組，說明微乳凝膠組在體內(nèi)吸收較普通凝膠組快且平穩(wěn)，而消除較慢，證明微乳可在角質(zhì)層和真皮層形成藥物儲庫，使其在皮內(nèi)的一定深度緩慢釋藥，因此具有作用平緩、血藥濃度更加平穩(wěn)的優(yōu)點，與體外經(jīng)皮滲透性實驗結(jié)論一致[7]。由圖3和表2可以看出，普通凝膠組皮膚中雪甲素濃度較微

乳凝膠組增加快速，達(dá)峰后藥物濃度降低也較快速。

說明藥物在皮膚中的濃度變化與在血液中的濃度變化有一定的相關(guān)性。由此可見，雪上一枝蒿總堿微乳凝膠經(jīng)皮給藥，具有穩(wěn)定血藥濃度，提高生物利用度等優(yōu)點。

[參考文獻]

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[3]M E Dalmora， S L Dalmora， A G Oliveira Inclusion complex of piroxicam with βcyclodextrin and incorporation in cationic microemulsion In vitro drug release and in vivo topical antiinflammatory effect[J] Int J Pharm，2001，222（1）： 45

[4]吳玉梅，陳曉蘭，林亞平，等雪上一枝蒿總生物堿微乳的研制與質(zhì)量評價[J]中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（23）：7

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[責(zé)任編輯曹陽陽]