小麥miRNA研究進展

李洪振 宋金鵬?┝醵?升 胡文剛 宮文萍 劉成 韓冉 劉建軍

摘要：microRNA（miRNA）是真核生物體內普遍存在的一類具有重要調控功能的非編碼小分子RNA（sRNA）。研究表明，miRNA參與基因轉錄后調控，在植物的生長、發育和逆境脅迫應答等生物學過程中發揮著重要調節作用。截至目前，對植物miRNA的研究已經取得了較大進展，但小麥miRNA研究才剛具雛形。通過生物信息學預測和sRNA高通量測序手段，已得到部分小麥miRNA。小麥miRNA的功能研究方法也有了初步結果。本文就小麥miRNA的識別、時空表達特性、抗逆相關特性及其功能研究方法進行總結分析，為今后小麥miRNA的研究提供參考。

關鍵詞：miRNA；小麥；高通量測序

中圖分類號：S512.101文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0147-05

microRNA（miRNA）是近年來發現的真核生物體內普遍存在的一類具有重要調控功能的非編碼小分子RNA（sRNA），其長度在20～25 bp之間。大量研究發現，miRNA參與基因轉錄后調控，在植物的生長、發育和逆境脅迫應答等生物學過程中發揮著重要的調節作用。迄今，植物miRNA的研究已經取得了較大進展，miRBase數據庫（Release 21： June 2014； http：//www.mirbase.org）中登錄注冊的植物成熟miRNA已有10 892條，其中絕大多數miRNA來自全基因組序列已知的水稻（713條）、擬南芥（427條）、二穗短柄草（525條）和玉米（321條）等物種。相比之下，小麥染色體組復雜，基因組龐大，全基因組測序雖已完成[1]，但序列組裝尚待完成，在miRBase中登錄注冊的miRNA僅有119條。因此，小麥miRNA研究還需進一步加強。本研究就植物miRNA的生物合成，小麥miRNA的識別、時空表達特性、抗逆相關特性及其功能研究方法進行了總結。

1植物miRNA的生物合成

和動物miRNA不同，大部分植物miRNA基因定位于基因間區域，不成簇聚集[2]，其在基因組上具有一個獨立的轉錄單元，可加工成多條miRNA。miRNA在植物體內的合成較為復雜，需要多種酶和功能蛋白的參與。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的作用下轉錄成一條或多條初級轉錄產物（primiRNA），隨后，與RNA結合蛋白DAWDLE（DDL）結合進入細胞核加工中心（Dbody），在雙鏈RNA酶結合蛋白（HYL1）、Dicer like 1（DCL1）酶、鋅脂蛋白（SE）和核酸CAP結合復合體（CBC）的作用下，primiRNA被加工成具有特定二級莖環結構的miRNA 前體（premiRNA）；premiRNA在Hasty（HST）和其他蛋白因子的作用下被轉運到細胞質中，在DCL1酶的酶切作用下形成成熟miRNA復合體（Mature RNA duplexes），隨后，在HEN1和HYL1等酶的作用下形成成熟的miRNA；成熟miRNA與Argonaute（AGO）蛋白相互作用形成RNA誘導沉默復合物體（RNAinduced silencing complex，RISC），最后與靶基因結合行使其功能[3，4]。

2小麥miRNA研究進展

2.1小麥miRNA的識別

植物miRNA的識別方法主要有直接克隆法、生物信息預測法和高通量測序法三種方法。直接克隆法是先建sRNA庫，再測序[5～7]。生物信息預測法是根據miRNA序列在物種間的保守性和miRNA莖環結構的特殊性搜索同源miRNA[7，8]。二代測序技術的發展為miRNA的識別提供了平臺，高通量測序技術具有規模大和靈敏度高等優點，是目前植物miRNA識別運用最廣泛的一種技術。由于植物體內有較多與miRNA相似的sRNA，在鑒定過程中容易與miRNA混淆。針對這一點，科學家們根據miRNA的特殊二級結構設置了辨別miRNA真偽的標準[9～12]。

植物miRNA的保守性為小麥miRNA的識別提供了方便。2005 年，Zhang等對小麥 EST 數據庫進行分析，共獲得 16 條小麥 miRNA，分屬于9個miRNA家族[13]；Jin等利用基因組的支持向量機程序對小麥EST進行分析，共得到79條候選miRNA[14]。小麥基因組測序及單條染色體的分離和測序，為小麥miRNA的識別提供了更多的資源。Lucas等在小麥1AL染色體上鑒定了42條保守miRNA[15]。2014年，Kurtoglu等利用小麥基因組Shortgun測序結果進行已知miRNA的同源搜索，共得到52條miRNA[16]。高通量測序技術的發展加快了miRNA的識別速度。Yao等[17]和Wei等[18]利用高通量測序技術對小麥sRNA文庫進行測序，分別得到了58條和70條miRNA。Li等以小麥7天幼苗為材料，提取RNA進行sRNA測序分析，共得到分屬于32個家族的miRNA，并用降解組測序方法驗證了這些miRNA的53個靶基因[19]。Chen等對高產小麥Yunong 201及其突變體Yunong 3114分別進行sRNA測序，分別獲得924條和1 325條miRNA[20]。

2.2小麥miRNA的時空表達特性

植物miRNA的時空表達特異性分析主要是運用試驗手段和高通量分析進行的，其中，試驗方法運用較廣泛的是Northern blot和RTqPCR。Northern blot能夠根據特定miRNA設計探針，進而針對植物不同組織或發育時期進行miRNA的表達模式分析[21]，其缺點是靈敏度較低，很難檢測到低豐度的miRNA。RTqPCR以其高靈敏度、低成本和操作簡單等優勢被廣泛應用于miRNA表達模式分析上[22， 23]。Han等以小麥為研究材料，對目前植物應用最廣泛的莖環RTqPCR （stemloop RTqPCR）和加A RTqPCR （poly（A） RTqPCR） 方法進行評價，認為poly（A） RTqPCR更適用于小麥miRNA研究[24]。高通量分析方法主要包括miRNA芯片和高通量測序。miRNA芯片可以對不同發育時期、生物和非生物脅迫條件下所有植物的miRNA進行表達模式分析，但是，目前miRNA的探針有限，僅能檢測到已知miRNA。高通量測序不僅可以鑒定特定條件下的已知miRNA，還能夠同時檢測到新miRNA和低豐度miRNA，并將其表達量用reads數來表示，從而揭示其差異表達模式。

Yao和Xin等對鑒定得到的小麥miRNA進行Northern blot表達分析，發現miR502在莖間、根和葉中高表達；miR507和miR509在根中高表達，在莖和莖間中表達量減少，在葉、旗葉和穗中表達量極低；miR513和miR514在根中高表達；miR515只在根和葉中表達；miR2003和miR2004在莖、穗和根中的表達量高于在葉中的表達；miR2001和miR2011在葉和根中表達量高于莖和穗[17， 25]。Meng等通過高通量測序技術在小麥發育期的籽粒中得到605條保守miRNA和268條新miRNA，推測其中的 86條保守miRNA可能參與調控小麥籽粒的灌漿，18條新miRNA可能對小麥籽粒的成熟有重要作用[26]。Han等對小麥五葉期幼苗、孕穗期旗葉以及揚花后5、10、20天的小麥籽粒進行sRNA測序，共得到24條已知miRNA和55條新miRNA。時空表達模式分析發現，已知miRNA中的miR160、miR164、miR166和miR169在籽粒中的表達量高于其他組織/器官，miR156、miR172、miR168、miR396、miR159、miR398、miR1318、miR167在旗葉的表達量高于其他組織/器官；55條新miRNA中的22條在籽粒中表達量高于其他組織（其中有12條只在籽粒中表達），28條在旗葉的表達量高于其他組織/器官[27]。Li等以7、14、21、28天的中國春小麥籽粒為材料，通過sRNA和降解組測序共獲得186條保守miRNA和37條新miRNA。進一步分析發現，其中的55個miRNA家族在四個籽粒發育時期表達模式不同，miR408和miR5048的表達量隨著籽粒的生長而升高；miR319和miR827在籽粒發育前期表達量逐漸升高，在籽粒發育后期，其表達量又逐漸降低；miR169、miR165和miR444等隨著籽粒的生長其表達量逐漸降低[28]。

2.3小麥miRNA與逆境脅迫的關系

miRNA不但與植物的生長發育和花發育相關[29～31]，還與逆境脅迫相關[32]。部分miRNA的靶基因為轉錄因子，在植物中具有組織特異表達特性[30， 33]。Xin等分析了白粉菌侵染前后和熱脅迫前后小麥葉片中miRNA的豐度變化，在鑒定出的153條miRNA中分別有24條和12條miRNA的表達量在白粉病侵染前后、熱脅迫前后發生了明顯變化[25]。馮浩對苗期感病但成株期抗病的小麥品種興資9104進行條銹菌接種，研究15條miRNA在不同時間點的表達變化情況，結果發現，它們均能受條銹菌侵染的誘導，并呈現出多種表達趨勢，這表明興資9104的條銹病抗/感性狀并不是由某一條或者一類miRNA調控決定的，而是多條miRNA共同調控的結果[34]。

研究發現，擬南芥在生物脅迫和非生物脅迫下，miR393、miR167和miR160表達量均會出現變化[35]。Tang等發現miR167、miR393、miR172、miR396和miR444在小麥受到冷脅迫后，其表達量也發生了明顯變化[36]。當小麥受到低溫處理時，隨著溫度的降低，miR165、miR166和miR319的表達量呈現先升后降的趨勢，但是，當小麥在同時受到低溫和外源ABA脅迫時，miR165和miR166的表達量呈現降升降趨勢，miR319呈先降后升的趨勢，說明ABA改變了這三條miRNA的表達模式[37]。

2.4小麥miRNA功能研究方法

在植物中，miRNA的功能主要是通過調節其靶mRNA來實現的，調控方式與siRNA（Small interfering RNA）相似，即通過類似于RNA干擾的機制來切割或者是抑制靶基因表達來實現的[7，30，38]。miRNA切割目標mRNA是使與其互補配對區域的某兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵發生斷裂[38]，鍵的斷裂主要是由具有核酸內切酶活性的AGO1蛋白介導[39，40]。

植物miRNA還能在轉錄水平上介導靶標DNA的甲基化。Khraiwesh等對小立碗鮮DCLl基因缺失突變體中的miRNA和其靶mRNA豐度進行研究發現，靶mRNA并未發生切割，但其轉錄本水平卻大幅度降低，其原因是這些突變體積累的miRNA與靶標形成miRNA：靶標mRNA雙聯體，進而使編碼靶mRNA的基因過度甲基化而發生沉默[41]。Wu等也報道了水稻中一類由DCL3切割產生的長度為24 nt的新miRNA（long miRNA，簡寫為lmiRNA）。該項研究證實了lmiRNA可以依據其產生機制和5′末端核苷酸選擇結合AGO4蛋白，然后招募重新甲基轉移酶DRM2甲基化其鄰近的靶基因，從而在轉錄水平上進行基因的表達調控[42]。

2.4.1小麥miRNA功能研究方法基因功能的研究一般采用基因的過表達或者干擾（抑制、敲除）的方法進行，miRNA的功能研究也不例外，但是，miRNA行使功能的只是21 bp長度的成熟miRNA，不同于其它功能基因。利用轉基因手段轉化miRNA的前體序列是研究其功能最常用的方法之一[43， 44]。借助病毒載體瞬時過表達miRNA是近年來發展起來研究其功能的方法。Feng等用含有小麥miR159前體的大麥條斑花葉病毒（BSMV）侵染小麥，然后，利用Northern blot對其進行分析，結果發現，小麥體內miR159含量明顯高于只接種BSMV的小麥植株，認為miRNA表達量的增加是由病毒攜帶的miR159前體通過siRNA切割方式形成的[45]。韓冉利用同樣方法在小麥中瞬時過表達了miR156，發現miR156的增加可導致小麥抽穗時間延遲[46]。

STTM（Short tandem target mimic）短串聯靶標類似物，是人工合成的一段短的目標重復序列，兩端為目標miRNA結合位點。該序列能結合目標 miRNA，從而能有效阻止miRNA與目的基因的結合，導致目的基因的積累，是研究目標miRNA功能的重要介質[47～49]。目前，已有利用STTM技術研究小麥miRNA功能的報道。Jiao等將含有miR159和miR3134a的STTM分別連接到BSMV載體上，然后分別侵染小麥，結果發現，miR159和miR3134a的表達量較對照均明顯減少[50]。

2.4.2小麥miRNA功能研究由于小麥miRNA研究起步較晚，目前對其研究還處于鑒定、功能預測和功能相關性研究上。目前，小麥miRNA功能研究主要是通過對靶基因的功能預測來實現的。Yao等通過搜索小麥EST數據庫，在232條小麥miRNA中共檢測得到189條靶基因，并指出在小麥和其它植物中保守的miRNA，其靶基因序列也比較保守，這些靶基因涉及到部分轉錄因子，其功能主要是調控植物的生長發育和參與逆境脅迫；對于小麥特有的miRNA，其靶基因主要參與細胞代謝和生物非生物脅迫[51]。

3展望

綜上所述，雖然小麥miRNA研究起步較晚，miRBase數據庫中注冊的小麥miRNA數量較少，但是，近年來小麥miRNA的預測與鑒定研究進展很快。目前，已鑒定出的小麥miRNA有1 500多條，miRNA功能研究方法也逐漸完善。相信隨著小麥全基因組組裝的完成以及生物信息學等新技術的發展，小麥 miRNA 的研究會更為全面和深入。

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