四川省十五個桑樹主栽品種SRAP分子標記分析

張楠 丁祥 錢葉 危玲 黃蓋群

摘 要 利用SRAP分子標記研究了四川省15個主栽桑樹品種的遺傳多樣性，探討其的基因結構特點，明晰其種質的親緣關系。對擴增后的條帶進行測序，利用DNAMAN分析軟件分析15個品種的遺傳關系，15份品種可被分為4大類。結果表明，SRAP標記技術在評價四川省15個主栽桑樹品種的親緣關系和遺傳多樣性等方面具有很好的適用性，可為桑樹種質資源DNA指紋圖譜的建立及品種間鑒定提供科學依據。

關鍵詞 桑樹；SRAP分子標記；遺傳多樣性；四川省

中圖分類號：S888 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）15--02

我國是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一[1]，栽桑歷史悠久。我國桑樹育種工作者從20世紀30年代開始進行桑品種的選種工作，截止目前，我國共保存桑樹種質資源近3 000余份，分屬15個桑種及4個變種，其中栽培種5個，野生種10個，是世界上桑種最多的國家。

開展對桑樹不同品種的親緣關系及遺傳多樣性研究，對桑樹種質量資源收集、核心種質保存及新品種選育均具有重要意義。本研究通過從桑樹幼嫩葉片中提取基因組DNA，采用SRAP技術對15個桑品種的遺傳背景和遺傳關系進行分析鑒定，從DNA水平上對桑樹種質資源的遺傳多樣性進行鑒定及核心種質的確定，為桑樹品種重要農藝性狀基因的發掘與利用提供理論依據和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為保存于四川省農業科學院蠶業研究所桑樹種質資源圃的地方種質資源15份。2015年7月上旬采取15個四川省主要栽培品種健壯、無病蟲害植株的幼嫩葉片10 g左右裝入50 mL離心管中，及時編號裝入冷藏采樣箱暫存，保存于-80 ℃超低溫冷凍冰箱，取樣應在上午氣溫未升高，即09：00前完成。

1.2 DNA提取

DNA提取采用從北京天根生物技術有限公司所購買的植物基因組DNA提取試劑盒進行桑葉DNA的提取。

1.3 SRAP引物

SRAP序列來自加拿大哥倫比亞大學（UBC），引物合成于深圳華大基因科技服務有限公司。

1.4 PCR擴增

SRAP-PCR反應體系25 ul，包括40 ng模板DNA、1 ul引物（10 ng/ul）、1UTaq DNA聚合酶、2.5 ul10×PCR buffer和0.5 uldNTPs（10 mmol/L），ddH2O補足至25 ul。

SRAP-PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5個循環；94℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[2，3]。所用PCR儀為美國所產BIO-RAD T100 Thermal Cycler。擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠（通過提高瓊脂糖濃度使得條帶分散顯得更清晰）（含0.5 ug/L Gold ViewⅡ型核酸染料）電泳進行檢測，并使用凝膠成像系統對電泳結果進行拍照記錄。

1.5 數據分析

50對SRAP引物對桑樹總DNA進行PCR擴增，其中5對引物能夠擴增出得到穩定，清晰并且容易計數的條帶，在這5對引物中挑選一對PCR擴增產物進行條帶回收測序，本次實驗選用的是第11號SRAP引物進行測序分析。測序所得結果采用DNAMAN軟件進行比較分析，鑒定這15個品種間的遺傳關系，并對其進行分類。

2 結果與分析

以15個桑品種SRAP-PCR擴增反應產生的條多態性條帶為基礎數據，對11號引物擴增所得條帶進行回收并且測序。利用DNAMAN軟件對測序后的結果進行比對分析，結果顯示，SRAP可將這15個桑品種分為四大類，其中川7637單獨為一類，即第一大類；臺灣果桑和川826為一大類，即第二大類；農桑14號，湘7920，川桑48-3，川桑83-5，新之一瀨，實鈷11-6，蜀葚1號，川7431，川桑98-1，油桑，川桑83-6為一大類，即第三大類；湖桑32號單位為一大類，即第四大類。

3 結論與討論

SRAP標記技術是一種基于PCR水平上發展起來的新型分子標記技術，由美國加州大學蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發出來[4]。而一個物種的多樣性主要包括遺傳多樣性，但是其會受到諸多因素的影響，如地理分布、氣候變化、物種的遺傳變異和進化地位等。本研究利用50條SRAP引物種篩選得到5條多態性高、穩定性強的引物，對15個桑種總DNA進行擴增反應，選取其中一條引物擴增所得條帶進行測序分析（本實驗所選引物為第11號引物），測序所得結果采用DNAMAN軟件進行數據分析，在測序水平上SRAP11可將這15個引物分為四個大類，每大類中同一生態環境、靠近或同在一個地理位置的資源，親緣關系越近，遺傳距離也就更近。結果顯示，本研究所選桑種種質資源遺傳基礎較豐富，而經過篩選所得的引物在評價桑樹品種的親緣關系和遺傳多樣性等方面有很好的適用性。

參考文獻

[1]陳仁芳，張澤，唐洲，等.桑屬ITS、trnL-F、rps16序列與進化分析[J].中國農業科學，2011（44）：1553-1561.

[2]林強，邱長玉，趙衛國，等.32份廣東桑類型桑樹種質資源親緣關系的SRAP標記分析[J].蠶業科學，2011（37）：373-379.

[3]王華忠，吳則東，王曉武，等.利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學報，2008（34）：37-46.

[4]林強，朱方容，邱長玉，等.廣西桑樹種質資源親緣關系的SRAP分析[J].南方農業學報，2011（42）：358-363.

（責任編輯：趙中正）