火龍果多糖提取純化及單糖組成檢測

秦復霞

摘 要 目的：使用HPLC方法分析火龍果多糖的單糖組成。方法：采用水提、Sevag脫蛋白及柱色譜層析等方法提取、純化火龍果多糖，之后優化多糖TFA酸水解條件。使用高效液相色譜PMP衍生化法測定火龍果多糖單糖組成。結果：提取到火龍果多糖具有多糖類物質紫外-可見光特征吸收。火龍果多糖最佳TFA酸水解條件為TFA濃度2 mol/L、水解溫度120 ℃、水解時間6 h。火龍果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖組成。

關鍵詞 火龍果；PMP衍生化；單糖組成；液相色譜

中圖分類號：S668.9 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）15--03

火龍果是仙人掌科（Cactaceae）三角柱屬（Hylocereusundatus Britton et Rose）和蛇鞭柱屬（SeleniereusMeja-lantous Britton et Rose）的果用栽培品種，其外觀猶如鱗片狀因而得名火龍果，又稱青龍果、紅龍果、仙人掌果等，是一種具有很高觀賞性和營養價值的品種[1-2]。火龍果原產于中美洲熱帶地區，后經移植至東南亞等國后傳入我國廣東、廣西、臺灣等地區。因其富含植物性多糖、礦物元素、甾醇及維生素等營養物質[3]，具有增強人體機能、提高免疫力及美容養顏等功效，因此具有廣闊的開發前景和利用價值，近年來得到國內外學者的廣泛關注[4，5]。本文對火龍果中富含的活性物質植物多糖進行提取、純化，并采用高效液相色譜法鑒定了其單糖組成，為進一步加工利用火龍果資源提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

火龍果：購于農貿市場，產地海南。纖維素酶、Sephadex LH-20、單糖對照品（葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖）：上海源葉生物科技有限公司。三氟乙酸、重蒸酚、PMP：北京索萊寶科技有限公司。乙腈為色譜純。甲醇、乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、濃鹽酸等為分析純。

DS-I型高速組織搗碎機；真空冷凍干燥機；BS-100A自動部分收集器；KQ5200DE型數控超聲波自動清洗器；759MC紫外可見分光光度計；DZF-6050型真空干燥箱；SHB-B95循環水式真空泵；DT5-4B型低速臺式離心機；0.45μm水相過濾膜；Zorbax SB C18；安捷倫高效液相色譜儀Agilent 1100。

1.2 火龍果多糖的提取、純化及鑒定

本實驗采用超聲輔助的方法提取火龍果多糖，提取參數參考熊建文等人的方法[6]并加以改進。取新鮮火龍果去皮去籽后于組織斬碎器中充分斬碎，之后取適量火龍果果肉漿進行熱水回流提取。提取完成后抽濾，將得到的濾液放入真空冷凍干燥機中干燥，得到火龍果組織粗提物。取粗提物10 g溶于200 mL蒸餾水中并加入0.600 g纖維素酶，在最佳條件下水解1 h滅酶冷卻，之后于65 ℃下超聲提取50 min。結束后4 500 r/min離心15 min，收集上清液。將上清液按液料比1∶4加入氯仿-正丁醇混合液（4∶1）并充分振搖30 min，充分靜置溶液分層后棄去沉淀，如此反復3次以除去蛋白質。將溶液冷凍干燥得到火龍果粗多糖。

使用凝膠色譜層析純化得到的火龍果粗多糖，填料選用Sephadex LH-20。操作步驟：取100 mg火龍果粗糖充分溶解于10 mL超純水中，使用0.45 μm水相膜過濾后上樣。洗脫液為超純水，流速12 mL/h，每管收集40 min，收集50管。使用苯酚-硫酸法逐管測定490 nm下吸光度，收集洗脫峰并凍干[7]。使用紫外-可見光全光譜掃描法（200～800 nm）鑒定火龍果多糖提取物的性質。

1.3 火龍果多糖TFA酸水解條件優化

火龍果多糖水解條件正交實驗因素和水平見表1，采用L9（34）正交實驗設計。精確稱取火龍果多糖10.0 mg于具塞試管中，加入2 mL不同濃度的三氟乙酸，氮氣置換后封管于烘箱中恒定溫度下水解一定時間。結束后加入4 mL甲醇溶液充分振搖后放入真空烘干箱中烘干，反復3次以除去三氟乙酸。

表1 火龍果多糖TFA酸水解正交實驗因素與水平表

重復 酸濃度/（mol/L） 水解溫度/℃ 水解時間/h

1 1 80 3

2 2 100 6

3 4 120 9

1.4 HPLC-DAD法測定單糖組成

1.4.1 單糖對照品和火龍果多糖水解物衍生化

分別取葡萄糖、果糖對照品各3mg于同一試管中，加入0.3 mol/L NaOH溶液5 mL充分振蕩。取100 μL溶液加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液50 μL，放入70 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min后冷卻至室溫，之后添加0.3 mol/L鹽酸100 μL中和。將衍生化后的糖液按1∶1的料液比與水-氯仿（1∶1）混合液混合并充分振蕩離心。棄去氯仿層后再次加入適量氯仿萃取，重復3次以完全除去PMP，然后使用0.45μm水相濾膜過濾后冷藏備用[8，9]。取火龍果多糖水解殘渣3mg，處理步驟與對照品單糖相同。

1.4.2 色譜條件

色譜柱采用Zorbax SB C18，流動相為乙腈∶水=25∶75，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測器波長245 nm，進樣量10 μL。

1.4.3 系統適用性參數

使用衍生化后的單糖對照品進行系統精密度測定，進樣5次，進樣量10μL。結果顯示，單糖對照品衍生化物峰的保留時間RSD值均小于0.22%，峰面積的RSD值均小于0.51%，理論塔板數不低于3 000。

2 結果與分析

2.1 火龍果多糖提取、純化及鑒定

火龍果粗多糖柱層析吸光度圖譜見圖1。火龍果粗多糖經過Sephadex LH-20葡聚糖凝膠純化后得到一個吸收峰，收集吸收峰對應的試管溶液并進行全光譜掃描，掃描結果見圖2。掃描結果顯示，吸收圖譜是多糖類物質典型的雙曲線型，在250 nm和280 nm處無明顯吸收，說明幾乎不含核酸和蛋白類雜質[10]。

2.2 多糖單糖組成測定

分別取衍生化后的混合單糖對照品和火龍果多糖水解液按照1.4.2中色譜條件進樣，六種混合單糖對照品PMP衍生化物HPLC圖譜見圖3，火龍果多糖水解液衍生化HPLC色譜圖見圖4。可以看出火龍果多糖由組成葡萄糖、果糖、阿拉伯糖組成。

2.3 火龍果多糖TFA最佳水解條件

以火龍果多糖水解產物洗脫峰面積為指標，使用SPSS12.0統計軟件中正交設計分析工具分析測定指標，優化火龍果多糖TFA水解條件。優化結果表明，酸濃度、水解時間、水解溫度3個因素間具有顯著性差異（P<0.05）。Post Hoc Tests析因分析（α=0.05）表明TFA最佳水解條件為：酸濃度2 mol/L、水解溫度120 ℃、水解時間6 h。

3 結論

采用熱水回流提取的方法優化了火龍果粗多糖的提取步驟，并通過Sevag法及Sephadex LH-20柱層析純化提取得到的火龍果粗多糖。經過紫外-可見光全光譜掃描驗證得到的火龍果多糖具有一般多糖的特征吸收曲線。優化了TFA法水解火龍果多糖的條件，結果顯示，10 mg火龍果多糖中加入2 mL濃度為2 mol/L的TFA，在120 ℃下水解6h得到的單糖產率最高。該方法通過反復加入甲醇以除去TFA，相比其他水解方法提高了后續步驟中液相分析的分辨率并降低了單糖損失。根據單糖類物質經過PMP衍生化后在特定波長處有紫外吸收的特性，本實驗設計了PMP衍生化法測定火龍果單糖組成的方法，結果表明火龍果多糖主要由葡萄糖、果糖和阿拉伯糖組成。

參考文獻

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（責任編輯：劉昀）