分子生物學(xué)方法在土壤線蟲(chóng)群落研究中的應(yīng)用

李孟潔 張靖楠 劉君鋒 張鈺倩

摘 要 線蟲(chóng)群落組成可作為評(píng)估土壤環(huán)境質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。分子生物學(xué)手段為解決傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)行群落組成分析工作量較大，專業(yè)知識(shí)需求高，鑒定結(jié)果的一致性易受干擾等問(wèn)題提供了新途徑，并具有樣品量小，檢測(cè)速度快，對(duì)近緣種區(qū)分度高等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 線蟲(chóng)多樣性；高通量測(cè)序；DGGE；分子生物學(xué)；遺傳標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S154 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1673-890X（2016）15--02

線蟲(chóng)在土壤食物網(wǎng)中占據(jù)較為重要的地位，常以土壤微生物為食，在土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)、改善土壤結(jié)構(gòu)以及植物演替中發(fā)揮著重要的作用，其群落組成的變化能夠反映所在生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況[1]。

傳統(tǒng)的線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)研究基于對(duì)土壤中線蟲(chóng)的人工分離和形態(tài)學(xué)鑒定，往往需要研究者具備專業(yè)的分類學(xué)知識(shí)，同時(shí)耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力。而且，由于線蟲(chóng)個(gè)體較小，物種的分類比較粗糙，往往只到科屬水平，使生態(tài)分析比較模糊或表面化。此外，由于提取方法和形態(tài)學(xué)分類依據(jù)的限制，科屬鑒定只能針對(duì)從土壤中獲取的很小一部分成年線蟲(chóng)個(gè)體，很難反映全部土壤線蟲(chóng)的狀態(tài)，且易受環(huán)境和人為因素的干擾，可能使后續(xù)群落結(jié)構(gòu)和區(qū)系分析結(jié)果在平行試驗(yàn)結(jié)果間缺乏一致性。

針對(duì)遺傳物質(zhì)的分子生物學(xué)方法在分類學(xué)上的引入為解決問(wèn)題提供了新的方法和思路。不同于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定對(duì)常規(guī)物種描述性的評(píng)估，采用分子生物學(xué)方法能針對(duì)少量樣品進(jìn)行分析，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度和對(duì)分類學(xué)專業(yè)知識(shí)的要求，提高了效率。此外，分子生物學(xué)技術(shù)也可以更容易地鑒定親緣種[2]，提高了研究的精度。本文針對(duì)線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)分析中分子生物學(xué)的研究應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述，分析了各種方法的利弊，為線蟲(chóng)分子生態(tài)學(xué)研究提供參考。

1 利用分子生物學(xué)方法對(duì)線蟲(chóng)群落的分析

1.1 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)能利用相對(duì)較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，進(jìn)行種內(nèi)特異性與種間多樣性的生物身份建立，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物種快速、準(zhǔn)確進(jìn)行識(shí)別和鑒定[3]，可用于與生物分類相關(guān)的生態(tài)學(xué)、保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域。基于DNA條形碼技術(shù)的線蟲(chóng)分類學(xué)研究已經(jīng)引起人們的關(guān)注。許多遺傳標(biāo)記（Genetic Markers）已被用于線蟲(chóng)的鑒定，包括SSU rDNA、LSU rDNA、ITS序列、COI等。

小亞基核糖體DNA（The ribosomal DNA small subunit，SSU rDNA）是最早用于標(biāo)記的片段，目前應(yīng)用較廣泛。它能有效描述某些線蟲(chóng)但不能完全解釋形態(tài)學(xué)研究觀察到的結(jié)果。對(duì)于線蟲(chóng)目和科水平的鑒定效果較好，但某些線蟲(chóng)種無(wú)法用SSU進(jìn)行區(qū)分。后來(lái)，人們嘗試用大亞基核糖體DNA（The ribosomal DNA large subunit ，LSU rDNA），但它需要多個(gè)區(qū)域的擴(kuò)增是有效的。利用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（The internal transcribed spacer，ITS）建立線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育分類系統(tǒng)。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（Cyctochromec oxidase subunit I，COI）具有引物通用性高和進(jìn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)，用于動(dòng)物分類鑒定較為理想。當(dāng)然，利用以上遺傳標(biāo)記的條形碼技術(shù)都一些問(wèn)題，如缺少同門(mén)范圍（phylum-wide）內(nèi)的引物，很難找到適宜用做條形碼的單一基因片段以鑒定全球范圍內(nèi)的線蟲(chóng)種類，進(jìn)而建立高通量測(cè)序的方法等。

1.2 PCR-DGGE

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）利用不同核酸序列或基因片段在變性梯度膠上電泳遷移率的不同將序列分開(kāi)，可以直接切下凝膠條帶測(cè)序，進(jìn)行群落內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析。有研究探討使用PCR-DGGE法分析線蟲(chóng)群落組成。Waite[4]等從草地土壤中直接提取環(huán)境DNA，針對(duì)SSU 18S rDNA序列，采用PCR-DGGC法研究土壤線蟲(chóng)群落的多樣性，并獲得了某些屬線蟲(chóng)的特異序列。但發(fā)現(xiàn)結(jié)果與之前進(jìn)行的基于形態(tài)學(xué)分類的研究結(jié)果不一致。并且，從結(jié)果很難獲取有關(guān)的遺傳多樣性或任何特定的類群的相對(duì)豐度的信息。Wang[5]等采用該法和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)銅污染土壤中線蟲(chóng)多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PCR-DGGE法對(duì)判別重金屬污染土壤中線蟲(chóng)多樣性具有可行性。但PCR-DGGE法存在一些缺點(diǎn)，如PCR引物可能存在擴(kuò)增的局限性；分離的DNA片段較小（最大為1 kb），序列信息有限；在不適宜的實(shí)驗(yàn)條件下，序列不同DNA片段不能完全分開(kāi)；只能檢測(cè)到環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)種群等。

1.3 PCR-TRLFP

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP），在PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上，根據(jù)限制性酶切片段長(zhǎng)度差異來(lái)檢測(cè)生物群落差異的一種指紋分析方法。該方法可用于不同生境的線蟲(chóng)群落研究。目前，已針對(duì)草地、農(nóng)田、沙丘、森林及沼澤地等生態(tài)系統(tǒng)開(kāi)展了相應(yīng)研究[6-8]，并獲得了較理想的結(jié)果。TRFLP最主要的優(yōu)點(diǎn)是能夠在不同序列運(yùn)行中比較數(shù)據(jù)，不像DGGE在凝膠之間比較。片段可以被精確地控制在700bp左右；超過(guò)這個(gè)規(guī)定的相關(guān)片段可以被控制在1000bp大小，分辨率相對(duì)較高。在96或384孔板可以進(jìn)行TRFLP，加上電子數(shù)據(jù)輸出和自動(dòng)自如，這意味著它是高通量與快速數(shù)據(jù)分析結(jié)合的方法。但是由于限制性酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切得不完全，會(huì)存在高估生物群落的多樣性。

1.4 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序在微生物生態(tài)學(xué)研究中已經(jīng)取得了比較理想的結(jié)果。因此，有研究者將該方法引入線蟲(chóng)多樣性的研究中。近幾年，二代測(cè)序技術(shù)（The next-generation sequencing，NGS），特別是454測(cè)序在線蟲(chóng)多樣性研究方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，定性或定量研究中，高通量測(cè)序結(jié)果都有比較好的一致性和重現(xiàn)性[9]。但也存在一些問(wèn)題，例如，雖然線蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種和常見(jiàn)種易被檢測(cè)，特定種屬的信息更加豐富，但還不能完全反映線蟲(chóng)群落組成。現(xiàn)有引物不具有線蟲(chóng)專一性，同時(shí)還會(huì)擴(kuò)增出真菌、植物或其他后生動(dòng)物的信息，易對(duì)聚類分析產(chǎn)生干擾。針對(duì)SSU rDNA的研究發(fā)現(xiàn)，先對(duì)土壤樣品中線蟲(chóng)進(jìn)行分離提取再進(jìn)行測(cè)序，可以降低真菌或植物OUTs的干擾，但會(huì)使聚類結(jié)果偏向某些定的種屬或特定生長(zhǎng)階段的線蟲(chóng)；而直接從土壤中獲取線蟲(chóng)DNA，又對(duì)引物的特異性有較高要求[10]。因此，線蟲(chóng)DNA的提取方法，遺傳標(biāo)價(jià)通用引物的選擇是下一步研究亟待解決的問(wèn)題。

2 結(jié)語(yǔ)

雖然存在局限性，但分子生物學(xué)手段的應(yīng)用拓寬了線蟲(chóng)學(xué)研究的廣度和深度。有報(bào)道表明，傳統(tǒng)分類學(xué)與分子方法對(duì)于線蟲(chóng)多樣性的研究結(jié)果的缺乏一致性，因此，建立傳統(tǒng)分類方法與分子方法的對(duì)應(yīng)關(guān)系是研究的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，分子技術(shù)要能反映特定種或某功能團(tuán)的相對(duì)多度。此外，高通量測(cè)序可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)土樣樣品的土壤線蟲(chóng)進(jìn)行大規(guī)模分析，但目前方法尚不成熟，未來(lái)基于遺傳標(biāo)記的高通量基因組研究將線蟲(chóng)生態(tài)學(xué)的發(fā)展方向之一。傳統(tǒng)分類學(xué)是分子手段的基礎(chǔ)，分子方法對(duì)大樣本的分析更加簡(jiǎn)便，二者彼此促進(jìn)，必將推動(dòng)土壤線蟲(chóng)分類學(xué)及群落研究的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：劉昀）