青藤堿對細胞凋亡的影響研究進展

謝怡敏　高永翔

摘要：青藤堿是青風藤的單體提取物，臨床廣泛運用于內風濕關節炎和內風濕疾病，近來越來越多的文獻顯示青藤堿對細胞的凋亡有調節作用。本文就青藤堿對細胞的凋亡的影響作用做一綜述。

關鍵詞：青藤堿；凋亡

調亡，又稱程序性細胞死亡，是機體內調控細胞死亡的一種重要機制，在多細胞生物的生長、發育及維持機體穩態等方面發揮著非常重要的作用。調亡與壞死不同，壞死作為細胞死亡的另一種形式，它會導致急性的炎癥反應，而調亡卻是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的主動死亡。調亡過多或過少都會導致疾病的發生。調亡的上調會造成細胞丟失紊亂，而下調則可能造成細胞增殖失控，進而導致癌癥的發生。

細胞凋亡包括一系列生物化學事件，引起細胞發生特征性形體變化和生物化學改變。形態學觀察細胞凋亡的變化是多階段的，細胞凋亡往往涉及單個細胞，即便是一小部分細胞也是非同步發生的。首先出現的是細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后是細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素C到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180～200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內側磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結構仍然完整，最終可將凋亡細胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。生物化學變化：①DNA的片段化：細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現象。這種降解非常特異并有規律，所產生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產生不同長度的寡聚核小體片段，實驗證明，DNA的有控降解是一種內源性核酸內切酶作用的結果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續圖譜；②大分子合成：細胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達和某些生物大分子的合成作為調控因子。如TFAR-19就是在細胞凋亡時高表達一種分子，再如在糖皮質激素誘導鼠胸腺細胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質合成抑制劑即能抑制細胞凋亡的發生。

細胞凋亡主要有三種通路[1]：一種是以Fas和TNFR為代表死亡受體信號轉導途徑，凋亡發生過程中伴有caspase-8的活化；第二種是以線粒體為核心的凋亡途徑，細胞色素C從線粒體釋放到胞漿與凋亡相關因子1（APaf-1）繼而與Caspase-9結合，引起Caspase-9自身剪切激活，啟動凋亡過程中伴有caspase-9的活化；第三種是以內質網為核心的凋亡途徑，凋亡過程中伴有caspase-12的活化。

調控細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖有關的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。

青藤堿（Sinomenine，SIN）是從防己科植物青藤（Sinomenium acutum （Thumb.） Rehd. Et Wils）及毛青藤（Sinomenium acutm （Thunb.） Rehd. et Wil. Var cinerrum Rehd. et al）的干燥藤莖青風藤的單體提取物，其分子式為C19H23NO4，分子量為329.28，是青風藤中所含的主要生物堿。青風藤味苦性平，歸肝、脾經，具有祛風濕、通經絡、鎮痛、利小便之功效，用于治療風濕痹痛、關節腫痛、麻痹瘙癢、水腫、腳氣等，其化學成分主要含有青藤堿、青風藤堿、雙青藤堿等，其中青藤堿具有抗炎、免疫抑制、鎮痛、降壓、抗心律失常等多種藥理作用[2]。20世紀初期，Ishiwari從日本青風藤中分離得到青藤堿單體，60年代我國學者朱任宏從國產青風藤中也發現青藤堿。臨床已有正清風痛寧片、緩釋片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿片等制劑用于治療類風濕關節炎及心律失常，且取得良好療效，近年來還有用于治療慢性腎炎、抗氧化、抗腫瘤、戒毒的報道。對于青藤堿的作用以往較多關注于抗炎止痛方面，而對于青藤堿對凋亡的作用，了解較少。近來越來越多的文獻顯示青藤堿對細胞的凋亡有調節作用。本文就青藤堿對細胞的凋亡作用做一綜述。

1 組織細胞

張茵 [3]等通過流式檢測細胞凋亡率，MTT比色法檢測SIN對成纖維細胞生長的抑制作用，發現光鏡及熒光顯微鏡下可見核固縮，變圓。熒光染色增強等凋亡形態學變化。流式細胞儀結果顯示，隨著SIN濃度及作用時間的增加，被處理的成纖維細胞凋亡率增加。

李樂[4]觀察不同劑量青藤堿對建立H2O2損傷模型的SD大鼠乳鼠心肌細胞凋亡率發現與空白對照組比較，心肌細胞凋亡率顯著增加，并隨時間延長其凋亡率不斷提高，SIN明顯抑制H2O2所誘導各個時間段的心肌細胞凋亡率，其機制可能與抗脂質氧化、抑制心肌細胞表達NF-kB有關。

王文君[5]運用細胞培養，流式細胞術等方法，觀察SIN對體外培養的RBL-2H3肥大細胞增殖凋亡以及活化脫顆粒的影響，結果顯示SIN對肥大細胞增殖有明顯抑制作用，并能促進肥大細胞凋亡，且對肥大細胞脫顆粒有較強抑制作用，因此發揮抗炎抗休克作用。

南華大學戴潤林通過流式檢測凋亡率，WB檢測p-ERK1/2蛋白表達，ELISA檢測IL-2表達，發現SIN能抑制IL-2的合成，并能誘導CD4+T細胞的凋亡，其分子生物學機制可能與其抑制p-ERK1/2蛋白信號及IL-2相關。

但也有研究顯示雖然SIN能影響細胞的增殖，但與凋亡無關。王海東[6]采用MTT及磷脂酰絲氨酸外翻分析發現SIN能顯著抑制刀豆蛋白（ConA）和混合淋巴細胞MLC激活的單個核細胞增殖，隨著濃度的增加其抑制作用加強，并與環孢素A（CsA）能夠顯著抑制ConA激活單個核細胞增殖，其作用途徑不是通過誘導單個核細胞的凋亡。

2 腫瘤細胞

蔣廷樞[7]等采用MTT法檢測SIN對非小細胞肺腺癌細胞NCI-H460細胞增殖，采用流式細胞AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡，TUNNEL法觀察細胞形態學變化，掃描電鏡觀察細胞超微結構的變化，發現：隨著SIN濃度的加大和作用時間的延長，其對細胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現明顯的時間-劑量效應關系。流式檢測表明，SIN作用48h，有明顯劑量依賴效應，隨濃度加大，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加，通過電鏡觀察，SIN作用后，凋亡細胞體積變小，胞質濃縮，胞漿內空泡增多，染色質固縮、邊集或碎裂成不規則塊狀，線粒體腫脹。

王曉潔[8]等采用MTT，流式，RT-PCR，WB檢測發現ERK，p-ERK表達隨處理濃度的增加而降低，MEK/ERK通路活化受抑制，且iSAPP-mRNA基因表達明顯降低，發現SIN能抑制肺癌細胞株Calu-1增殖，促進凋亡，其機制與MEK及ERK通路抑制有關。

吳敏[9]通過MTT法檢測SIN及其卡鉑聯合對宮頸癌Hela細胞增殖的影響，及流式對SIN處理后宮頸癌Hela細胞周期及凋亡觀察，發現SIN對Hela細胞的增殖有抑制作用，其機制可能與影響細胞周期分布、促進細胞凋亡有關。

龔立[10]應用形態學方法、AnnexinV熒光染色和流式檢測肝癌細胞株HepG2細胞凋亡，定量檢測ApO2.7及凋亡相關基因Bcl-2和Fas的表達，結果顯示SIN對HepG2細胞的生長有明顯的抑制作用，并誘導凋亡，其機制可能與Bcl-2和Fas基因表達，改善線粒體功能有關。

張增弟[11]發現SIN在體外能抑制食管癌EC109細胞增殖并促進凋亡，其機制與抑制COX-2和Survivin蛋白表達有關。

張毅[12]等通過電鏡、MTT、流式檢測等發現SIN對人前列腺癌DU145細胞增殖有抑制作用，同時促進DU145的凋亡，能有效抑制人前列腺癌。

Zhang JX[13]等運用CCK-8，Hoechst33258及Annexin V/PI研究SIN和5-FU（5氟尿嘧啶）單獨寄聯合使用對結腸癌的作用研究中，發現SIN和5-FU單獨及聯合運用于LoVo結腸癌細胞株移植的裸鼠后，能明顯抑制腫瘤的生長，SIN或5-FU單獨使用，可抑制LoVo結腸癌細胞株的增殖和促進凋亡，聯合使用效果較單獨使用效果明顯。WB顯示SIN和5-FU聯合作用的機制為促進Bax表達，抑制Bcl-2表達，同時，聯合作用后未見明顯副作用。

Li X[14]等在研究鹽酸青藤堿對乳腺癌的作用時發現鹽酸青藤堿引起了MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細胞株G1/S細胞周期停滯，導致細胞凋亡，引起了ATM/Chk2和ATR/Chh1通路調控的DNA損傷，而鹽酸青藤堿導致的DNA損傷是通過超氧化反應增強使活性氧（ROS）增加導致，用抗氧化劑NAC預處理后能阻斷鹽酸青藤堿導致的DNA 損傷。鹽酸青藤堿的抗腫瘤促凋亡作用與MAPK信號通路有關，鹽酸青藤堿能引起細胞株p-ERK，p-JNK，p-p38劑量依賴性的增加。而NAC預處理后，鹽酸青藤堿引起的這些信號分子的增加減弱。

通過眾多研究者的結果向我們展示了青藤堿在細胞凋亡中的效應。根據現有的資料，我們可以認為，不同的細胞類型，不同的發育狀態及多種因素的影響，決定了青藤堿在特定環境中發揮促凋亡的效應。進一步深入研究青藤堿對凋亡的分子機制，將使我們更好地理解青藤堿對內風濕等免疫性疾病的治療機制，同時為克服腫瘤尋找新的方法。

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編輯/哈濤