細胞間粘附分子5對抗阿糖胞苷抑制分析

楊和平，張貴強，謝榮漢，喬振虎，崔香香，韋英海

（1. 廣西壯族自治區民族醫院神經內科，廣西 南寧 530000；2. 桂林理工大學南寧分校，廣西 南寧 530000）

細胞間粘附分子5對抗阿糖胞苷抑制分析

楊和平1，張貴強1，謝榮漢2，喬振虎1，崔香香1，韋英海1

（1. 廣西壯族自治區民族醫院神經內科，廣西 南寧 530000；2. 桂林理工大學南寧分校，廣西 南寧 530000）

目的 分析細胞間粘附分子5（ICAM-5）對抗阿糖胞苷的抑制作用。方法 將轉染ICAM-5基因的PAJU-TLN細胞株與轉染空載體的PAJU-NEO細胞株分別添加阿糖胞苷培養，并于24 h、48 h與72 h時觀察兩組細胞株的形態變化、存活率與凋亡率。結果 兩組細胞株均受到阿糖胞苷一定程度的抑制，與PAJUNEO細胞株相比，PAJU-TLN細胞在72 h受到阿糖胞苷抑制的形態損害較輕，24 h、48 h、72 h的存活率明顯高于PAJU-NEO細胞株組，且凋亡率低于PAJU-NEO細胞株組。結論 ICAM-5在PAJU細胞表達后具有對抗阿糖胞苷抑制的作用，其能減輕細胞毒性，減少細胞凋亡，能夠保護和營養神經。

粘附分子5；PAJU細胞；阿糖胞苷；保護作用

細胞間粘附分子5（Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5）是指參與細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質之間相互作用的分子之一，是一種表達于神經元的糖蛋白，因其特異性地表達于端腦內，故又被稱作端腦素[1]。臨床研究認為，ICAM-5具有促進神經元生長、營養神經、抗神經元凋亡的作用，可以對抗神經系統的毒性損害[2]。而阿糖胞苷（arabinocytidine，Ara-C）是一種作用于細胞S增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，可通過抑制細胞的DNA合成，來干擾細胞的增殖，臨床多將該藥應用于急性白血病的治療中[3]。但Ara-C對神經元有一定的毒副作用，可能會誘導神經元凋亡，從而影響患者的智力。因此，臨床亟需采取有效措施來解決這一問題。鑒于ICAM-5具具有神經元保護作用，本文就分析ICAM-5具對抗阿糖胞苷抑制的機制，現作如下報道。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）基本器械設備：無菌操作室、凈化臺、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡倒置相差光學顯微鏡（TS100）、CO2培養箱、酶標儀、水純化系統、離心管、培養板、移液管及其他小器械（2）試劑：阿糖胞苷、胎牛血清、青/鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺（200 mmol/L）、DMEM/F12（體積比1：1）、HEPES（1 mmol/L）、二甲基亞砜、MTT、Hoechst、羊抗人ICAM-5多克隆抗體及兔抗羊異硫氰酸熒光素等；（3）細胞株：人ICAM-5常表達的人源性神經母細胞瘤細胞株PAJU細胞（PAJU-TLN）、無ICAM-5表達且轉染空載體的人源性神經母細胞瘤細胞株PAJU細胞（PAJU-NEO）。

1.2 方法

（1）細胞維持培養：將PAJU-TLN與PAJU-NEO均置于全培養基中維持培養，全培養基由青/鏈霉素溶液、HEPES、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM等試劑融合而成，PH值為7.3。將上述兩組細胞株置入全培養基中，并在37℃、5% CO2的培養箱中進行培養，每隔3～5d更換培養基，取對數生長期的細胞進行實驗操作。

（2）建立抑制細胞增殖模式：根據操作標準配制抑制培養試劑，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，將其置于4℃下避光保存。將備用的阿糖胞苷加入抑制培養液中并作最后配制。將對數生長期的PAJU-TLN和PAJU-NEO細胞株以胰蛋白酶消化后，將細胞密度調整至105個/mL。將細胞接種于準備好的無菌24孔板中，以兩株細胞的維持培養液培養24 h觀察細胞貼壁及生長情況。分別選取PAJU-TLN與PAJUNEO中生長良好的復孔3個，均加入含有阿糖胞苷的抑制培養液培養，連續觀察到72 h時細胞株死亡為實驗終點。分別取24 h、48 h、72 h三個時間段，在倒置相差顯微鏡下觀察PAJU-TLN與PAJU-NEO細胞株的存活情況。然后棄去孔內培養液，以PBS快速洗一遍，加入4%的多聚甲醛固定15～20 min，接著棄去多聚甲醛，再以PBS洗一遍。加入PBST滲透10 min，PBS振洗3次，以5%的BSA封閉30 min。加入羊抗人ICAM-5多克隆抗體，在濕盒37℃感作30 min后，于避光下加入綠色熒光標記的兔抗羊異硫氰酸熒光素，在濕盒37℃感作40 min，繼續避光，于熒光顯微鏡下觀察并照相存檔。

（3）細胞活性測：以105/孔的密度將PAJU-TLN與PAJU-NEO分別接種于96孔板中，分別在加有阿糖胞苷的抑制培養液中培養24 h、48 h、72 h三個時間段后，各孔分別加入MTT（sigma）繼續培養4 h。然后吸棄培養液，以二甲基亞砜溶解后，應用酶標儀檢測吸光度值。

（4）細胞核凋亡率檢測：將對數生長期PAJU-TLN與PAJU-NEO細胞以104密度接種于24孔板中，分別在加阿糖胞苷的抑制培養液中培養24 h、48 h、72 h定時取出，以PBS洗一遍。用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS振洗2次。以1mg/mL的Hoechst 33258（Sigma）避光染色15 min，封片后繼續避光，于熒光顯微鏡下觀察拍照，并計算細胞核的凋亡比例。

2 結 果

2.1 細胞形態

未添加阿糖胞苷時，PAJU-TLN與PAJU-NEO兩組細胞株在形態上無明顯差異；添加阿糖胞苷后，隨著時間不斷延長兩組細胞株形態也在不斷變化（見表1）。至抑制培養72 h，通過更換培養液PAJU-TLN細胞株可重新增殖傳代，而PAJU-NEO細胞株全部消亡，無法復活。

2.2 細胞存活率與凋亡率

未添加阿糖胞苷時，兩組細胞自然生存率基本一致；添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細胞24 h、48 h、72 h存活率明顯大于PAJU-NEO組細胞。正常培養條件下，經過Hoechst 33258細胞核染色，絕大多數細胞核呈彌散均勻的藍色熒光。添加阿糖胞苷前，兩組細胞凋亡率基本一致。添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細胞24 h、48 h、72 h凋亡率明顯小于PAJU-NEO組細胞。見表2。

表1 兩組細胞株形態

表2 兩組細胞株存活率與凋亡率

3 討 論

目前，臨床雖認為ICAM-5具有營養神經、抗神經元凋亡的作用，但對其抵抗阿糖胞苷抑制作用尚未見資料報道。文章便以ICAM-5對抗阿糖胞苷抑制為論點，進行試驗分析與論述。通過本次實驗發現，轉染空載體的PAJU-NEO細胞株在使用阿糖胞苷后，細胞形態明顯改變，72 h后細胞幾乎全部死亡；而轉染ICAM-5基因的PAJU-TLN細胞株使用阿糖胞苷后，72 h內形態損害較輕，雖出現細胞凋亡，但72 h仍有一半左右的細胞株存活，且可能繼續增殖傳代。由此認為，ICAM-5確有抵抗阿糖胞苷毒性，對PAJU細胞進行內源性保護和營養神經作用。

[1] 楊和平,彭 熠,楊力強,等.端腦素在缺氧環境中對PAJU細胞的保護作用[J].中國科技信息,2010,10(10)217-219.

[2] 宋琳衍.癌胚抗原相關細胞粘附分子5、6在膀胱尿路上皮癌組織中的表達及意義[J].中國老年學雜志,2013,11(33):5595-5596.

[3] 劉海龍,曲彥明,黃鉑淵,等.葉酸受體介導的阿糖胞苷抑制髓母細胞瘤增殖并促其凋亡的體外實驗研究[J].中華神經外科雜志,2015,31(5):514-518.

本文編輯：劉帥帥

R733.72

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ISSN.2095-6681.2016.30.075.02