鐵皮石斛飲片中有機氯及擬除蟲菊酯農藥多殘留檢測方法的研究

胡奇杰，朱佳茜，王新財，顧寬宇　(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江湖州 313000)

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鐵皮石斛飲片中有機氯及擬除蟲菊酯農藥多殘留檢測方法的研究

胡奇杰，朱佳茜，王新財，顧寬宇(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江湖州 313000)

摘要[目的]制定一套成熟的鐵皮石斛藥材中有機氯及擬除蟲菊酯農藥多殘留檢測方法。[方法]在空白鐵皮石斛中加入27種有機氯及擬除蟲菊酯標品，用水浸潤樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯用作為凈化方式，用GC-μECD檢測農藥殘留。[結果]試驗得出，建立的分析方法對各個農藥的回收率在79.6%～103.1%，重復性在1.98%～8.26%，符合農藥殘留檢測要求。[結論]研究可為中藥材中農藥的殘留檢測方法的制定和完善提供參考依據。

關鍵詞鐵皮石斛；有機氯及擬除蟲菊酯；凝膠凈化

農藥多殘留(Pesticide Residues)是指使用農藥之后一定時期內沒有被分/降解而殘留于生物體內、土壤、水體、大氣中的農藥原體、降解物和有毒代謝物及雜質的總稱。人們食用了被污染的中草藥后，殘留在其中的農藥便會積聚在體內，因其代謝緩慢，最終將導致急性或慢性中毒，產生嚴重的后果。因此世界各國對此高度重視，歐美等許多國家都對傳統藥和草藥制定了非常嚴格的農藥多殘留限量標準。農藥多殘留檢測屬于復雜混合物中痕量組分分析技術，中藥材農藥多殘留檢測具有以下特點：既需要精細的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測技術[1]。農藥多殘留量檢測方法的研究已成為影響中藥國際貿易的最重要技術要求之一，嚴重制約了中藥發展的國際化與現代化。因此，研制簡單、快速、準確，并可同時定性、定量的農藥多殘留檢測方法是保障人民用藥安全，推動中藥材現代化建設迫切需要解決的問題之一。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。試驗采用的鐵皮石斛，采購自湖州仁皇山街道康龍保健食品商行。所用水為經過二次蒸餾的重蒸水；丙酮、正己烷、環己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷，均為色譜純，默克公司；27種有機氯及擬除蟲菊酯標準品，國家標準物質研究中心；無水硫酸鈉，分析純，麥克林。

1.1.2主要儀器設備。GC-μECD(Agilent7890B)；凝膠凈化系統GPC、全自動固相萃取儀，萊伯泰科(LAB TECH)公司；高速勻漿機、旋轉蒸發儀，德國IKA；氮吹儀，美國Organomation；恒溫水浴振蕩器，上海精風儀器有限公司；旋渦混勻器(IKAM S1)；高速冷凍離心機，貝克曼。

1.2方法

1.2.1樣品處理。提取：稱取2 g鐵皮石斛過篩粉末于均質杯中，加入6 mL水，充分膨脹，然后加入10 mL丙酮和10 mL正己烷，15 000 r/min均質1 min，離心，然后再用5 mL丙酮和10 mL正己烷均質2次，合并上清液于加有10 mL飽和氯化鈉溶液的具塞量筒中，劇烈振蕩2 min，靜置20 min，分層。

GPC凈化：吸取上層有機相過無水硫酸鈉，旋轉蒸發至5 mL，轉移至玻璃管氮吹至近干，加6 mL乙酸乙酯+環己烷(1∶1)溶解。樣品過濾至GPC進行凈化，收集9.5～17.5 min流出液，40 ℃旋轉蒸發至5 mL，轉移至玻璃管氮吹至近干，加入2 mL丙酮。

SPE凈化：預先用5 mL丙酮+二氯甲烷(1+1)活化Carb-NH2柱，加入待凈化液使其逐滴留下，用5 mL×2丙酮+二氯甲烷(1+1)洗脫，收集洗脫液氮吹至近干，加入2 mL正己烷。將弗羅里硅土柱依次用5 mL丙酮+正己烷(1+9)、5 mL正己烷預淋洗，加入上述待凈化，用5 mL×2丙酮+正己烷(1+9)洗脫，收集洗脫液氮氣吹至近干，用正己烷定容至1 mL。

1.2.2GC色譜條件。色譜柱：安捷倫DB-1701(30 m×0.25 mm× 0.25 μm)；進樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：320 ℃；柱溫程序升溫：150 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至270 ℃，保持23 min；柱流速：1 mL/min；不分流進樣；載氣：氮氣，純度≥99.999%[2]。

2結果與分析

2.1提取過程加水的考察該試驗考察樣品在提取前加不加適量的水來考察提取效果，發現水浸潤后提取液澄清透明，因為加入適量的水能增加粉狀樣品之間的吸附力，經過離心后能完全達到固液分離。不加水，提取后提取液渾濁，并且有粉末和纖維漂浮在上面，從而影響后續的試驗。并且加了水能使提取溶劑更好地浸入樣品中，從而有利于農藥殘留的提取[3]。

通過試驗發現，不加水各個農藥回收率為38.2%～87.3%，而加水回收率提升到了78.6%～101.8%。因此，在有機溶劑提取樣品前應先加入適量的水浸潤。

2.2提取溶劑的選擇樣品前處理的提取方法是影響到整個試驗成功的關鍵因素，選擇提取溶解有2個關鍵因素：第一是將痕量農藥殘留完全從樣品中提取出來，第二是盡量少地溶解出雜質。根據有機氯及擬除蟲菊酯的理化性質和相似相溶原理，該試驗選擇乙腈、丙酮、正己烷、丙酮+正己烷4種提取溶劑考察提取效果。

通過試驗，發現除正己烷外其他3種溶劑提取能力相差不多，都能充分提取出農藥殘留，但乙腈具有微毒性，并且沸點高，濃縮困難。丙酮雖然滲透性強，但是對于色素、黃酮、酯類等一些物質也有很強的溶解性，在提取過程中也同時提取出大量的雜質，不易凈化。因此，不考慮乙腈和丙酮作為單獨提取溶劑[4]。

正己烷雖然對于色素溶解性差，但是不能充分滲透到樣品內部，且不能與水相溶，使得提取效率低，27種有機氯回收率在24.3%～58.1%，因此結合丙酮一起使用，既能充分地滲入樣品，也能相對較少地提取出其他的雜質，在滿足提取效果的前提下，也為后續的凈化打下基礎。

2.3提取方式的選擇中藥材基質復雜，提取難滲透，選用適宜的提取方法，能讓提取溶劑與鐵皮石斛基質充分接觸、滲透。該試驗選用振蕩提取、超聲波提取和高速均漿提取3種方法考察，發現振蕩提取效果較差，超聲波提取其次，高速勻漿法提取效果最好(表1)。

樣品中加入的提取溶劑的量對于振蕩提取影響比較大。通過試驗發現，提取溶劑加入量越大，提取的回收率越高，但是隨著提取溶劑增加，回收率提升的幅度越來越小。加入少量的溶劑，在振蕩提取中不能充分與樣品內部接觸，從而導致提取不充分，但是大量地增加溶劑會相應地增加成本，并且振蕩提取的時間也相對比較長。

超聲波提取也是農藥殘留常見的提取方法，但是在提取過程中，超聲波內部水溫會隨著提取時間增長而升高，而部分農藥殘留具有熱不穩定性及揮發性，因此造成了部分農藥殘留回收率低下。并且，在整個超聲容器中超聲波場的分布是不均勻的，類似在波場的分布中有死角，這會使得部分樣品的提取效率顯著下降，從而導致重現性較差。

使用高速均漿法能在較短時間內，用較少的溶劑得到較好的回收率，并且重現性也較好。高速均漿是樣品在高速攪拌下從攪拌縫隙高速噴出，高壓高速情況下使得鐵皮石斛的粉末進一步被破壞細化，從而使提取溶劑與鐵皮石斛粉末充分接觸，提高了提取效率，并且提取時間也進一步縮短。

該試驗也考察了超聲波與振蕩聯用、超聲波與均漿聯用、振蕩與均質聯用，發現超聲波與振蕩聯用回收率有了提高，但是還沒有達到試驗要求。后面兩者回收率與單獨使用均漿法相差不多，因此選用高速勻漿法作為該試驗的提取方法。

2.4GPC凈化條件的選擇凈化是利用農藥殘留與基體干擾雜質理化性質的差異，將雜質含量減少到能正常檢測目標農藥的殘留水平。GPC可以根據化合物各個分子的大小來實現分離，分子越大通過凝膠色譜柱的速度越快。由于鐵皮石斛中含有大量的色素、多糖類大分子物質，單純地用SPE不能完全除去樣品中的雜質，因此可以用GPC來初步凈化提取的樣品，盡可能多地除去色素、多糖類雜質[5]。

將濃度為0.5 μg/mL的27種農藥標準品混標注入GPC，以環己烷+乙酸乙酯(1+1)為流動相，流速為5 mL/min，通過紫外在線圖譜(圖1)，發現這些農藥在9.5～17.5 min通過凝膠柱進入檢測器。因此選擇9.5～17.5 min作為GPC凈化收集時間。

2.5SPE凈化柱的選擇通過GPC收集的流出液，發現還是有些顏色，說明有些色素等雜質跟隨農藥同時被洗脫收集。通過氣相色譜的檢測，發現雜質干擾目標峰的現象還是比較嚴重，因此選擇固相萃取(SPE)來凈化收集液，SPE是目前農藥殘留應用中最廣泛、效果也是比較好的方法[6]。

該試驗選擇Carb-NH2柱、弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱(表2)，發現通過C18柱和氨基柱的凈化，樣品中還是有很多雜質，使有些目標農殘被干擾或者覆蓋，可能這兩款柱子不能有效地吸附色素，從而不能達到理想的凈化效果。而Carb-NH2柱能有效去除樣品基質中的有機酸、色素和糖類雜質，弗羅里硅土柱能用于從非水溶液中吸附低極性以及中等極性化合物，有機氯及擬除蟲菊酯一般都是非極性或低極性的物質，通過試驗發現，Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱除雜效果較好，但還是有一些干擾雜質的存在。

通過Carb-NH2柱和弗羅里硅土柱聯合使用，凈化效果非常理想。先通過Carb-NH2柱除去樣品中的色素、糖類及有機酸物質，然后再用弗羅里硅土柱進一步除去一些極性的雜質，并且回收率也達到農藥殘留的要求，因此選用雙柱聯用的凈化方式。

2.6前處理方法學考證樣品中加入分成3組的27種有機氯及擬除蟲菊酯標準品，進行加標回收、檢出限及重復性試驗[7]。3組有機氯及擬除蟲菊酯空白樣品加標濃度為0.05 mg/kg的色譜圖見圖2。精密稱取鐵皮石斛樣品30份，各個農藥加標濃度為0.05 mg/kg和0.50 mg/kg 2個添加水平，重復試驗5次，通過GC-μECD檢測。試驗發現，各個農藥的回收率在79.6%～103.1%，重復性在1.98%～8.26%，符合農藥殘留檢測要求(表3)。

表2不同SPE對樣品的凈化效果及回收率

Table 2Effects of SPE on purification and recovery rate of sample

3結論

該試驗建立了27種有機氯及擬除蟲菊酯在中藥飲片鐵皮石斛中的GC-μECD的前處理方法：根據實驗室的實際條件，用水浸潤樣品，以丙酮和正己烷作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和弗羅里硅土、Carb-NH2柱固相萃取聯用作為凈化方式。該方法既可有效提取鐵皮石斛中農藥殘留，又可完全去除雜質干擾，簡便、省時、結果準確。所建立的分析方法對各個農藥的回收率在79.6%～103.1%，重復性在1.98%～8.26%，符合農藥殘留檢測要求，可推廣應用于中藥材中農藥的殘留檢測。

參考文獻

[1] 傅巧真，路俊仙，王萌.中藥材農藥殘留原因及防治措施的研究進展[J].時珍國醫國藥，2014(4)：925-927.

[2] 中華人民共和國農業部.蔬菜和水果中有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定：NY/T761-2008[S].北京：中國農業出版社，2008.

[3] 祝賀，宋愛華，田楊，等.GC-MS法同時測定中藥材中29種農藥殘留量[J].沈陽醫科大學學報，2007，24(6)：342-347.

[5] 吳巖，康慶賀，高凱揚，等.固相萃取-在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質譜法測定板栗中44種有機磷農藥殘留[J].分析化學研究簡報，2009，37(5)：753-757.

[6] 樓正云，陳宗懋，羅逢健，等.固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中殘留的 92 種農藥[J].色譜，2008，26(5)：568-576.

[7] ZHUANG W E，GONG Z B.Gel permeation chromatography purification and gas chromatography-mass spectrometry detection of multi-pesticide residues in traditional Chinese medicine[J]. American journal of analytical chemistry，2012(3)：24-32.

Detection Method of Organochlorine and Pyrethroid Pesticide Residue inDendrobiumofficinaleSlices

HU Qi-jie, ZHU Jia-xi, WANG Xin-cai et al

(Huzhou Institute for Food and Drug Control, Huzhou, Zhejiang 313000)

Key wordsDendrobiumofficinale; Organochlorine and pyrethroid; Gel purification

Abstract[Objective] To establish a mature detection method for organochlorine and pyrethroid pesticide residue inDendrobiumofficinaleslices. [Method] Standard substances of 27 organochlorines and pyrethroid were added intoD.officinale. After soaked in water, acetone and n-hexane were used as extraction solvent. With high-speed homogenate as the extraction means, GPC was combined with Florida silica and Carb-NH2column solid-phase extraction to purify the substances. [Result]GC-μECD detection found out that the recovery rate of each pesticide was 79.6%-103.1% with repeatability being 1.98%-8.26%, which met the requirements of the pesticide residue detection. [Conclusion] This research provides references for the establishment and improvement of pesticide residue detection method in Chinese Herbal Medicines.

基金項目浙江省公益技術研究農業項目(2014C32088)。

作者簡介胡奇杰(1980- )，男，浙江湖州人，高級工程師，碩士，從事食品科學研究。

收稿日期2016-01-26

中圖分類號S 481+.8

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-066-04