中藥復方提取物HNA-1對SIV慢性感染恒河猴胸腺輸出及胸腺細胞發育的影響

王小妹，陳　頌，陳瀅宇，胡　燕，張曉宇，寧興旺，朱惠斌*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗中心，湖南長沙410007；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405；3.湖南省第二人民醫院手足外科，湖南長沙410007）

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中藥復方提取物HNA-1對SIV慢性感染恒河猴胸腺輸出及胸腺細胞發育的影響

王小妹1，陳頌2，陳瀅宇2，胡燕1，張曉宇3，寧興旺1，朱惠斌*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗中心，湖南長沙410007；2.廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東廣州510405；3.湖南省第二人民醫院手足外科，湖南長沙410007）

〔摘要〕目的探討中藥復方提取物湘A-1號方（HNA-1,湖南省艾滋病防治小組推薦免費使用的兩個中藥復方之一的提取物）治療HIV-1感染及艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）的療效機制。方法用8只已感染猴免疫缺陷病毒SIVmac239 16～21個月的中國恒河猴，治療組采用2個月的HNA-1治療；對照組給予等體積生理鹽水灌胃。在預設時間點采集外周血提取DNA，采用定量PCR檢測T細胞受體重排刪除環（T cell receptor excision circles, TRECs）來評價胸腺輸出功能；并用酶消化法分離胸腺細胞，利用流式細胞術檢測胸腺內CD34+前體細胞、CD4+T細胞發育各階段的比例改變。結果與模型對照組比較，HNA-1治療組胸腺細胞輸出明顯增加（P<0.05）；且胸腺內CD34+Lin-細胞比例明顯增加（P< 0.05），胸腺雙陽性T細胞（Double positive，DP）Ⅱ階段比例減少，而DPⅢ和DPⅣ階段比例均增加。結論HNA-1對艾滋病的療效可能與其能顯著增加胸腺輸出有關；其作用機制可能涉及增加胸腺內前體細胞數量、以及促進胸腺細胞細胞從DPⅡ階段發育至DPⅢ等。

〔關鍵詞〕湘A-號方；CD4+T細胞；胸腺輸出；胸腺細胞發育

艾滋病毒和宿主免疫系統的相互作用是艾滋病發病的關鍵因素。CD4+T是機體T細胞的重要功能群體，在機體的適應性免疫應答中發揮了關鍵作用，是HIV攻擊的主要靶細胞[1-2]。CD4+T淋巴細胞數量的進行性減少和CD4+T淋巴細胞功能的受損是免疫系統損害的重要表現，是HIV感染進展的標志[2]。

湘A-1號方（HNA-1,湖南省艾滋病防治小組推薦免費使用的兩個中藥復方之一的提取物）是治療艾滋病的有效方劑。本課題組在前期研究中發現HNA-1具有促進免疫重建的療效，且研究中未發現毒、副作用[3-4]；能改善模型小鼠的免疫缺陷、提高其CD4+T細胞數量[5]；能明顯提高猴免疫缺陷病毒SIV-mac239感染猴模型的CD4+T細胞數（尤其是初始型CD4+T細胞）、改善淋巴結組織結構的病理退變，對猴免疫缺陷病毒感染導致的免疫系統破壞具有一定的保護作用，同時有降低動物死亡率的趨勢[6]。本研究進一步利用流式細胞術和T細胞受體重排刪除環（T cell receptor excision cirles, TRECs）檢測的方法，探討HNA-1治療機制與初始型CD4+T細胞、胸腺輸出及胸腺細胞發育的關系。

1材料

1.1動物、藥物

1.1.1動物恒河猴8頭，全部為雄性，體質量4.75～7.2 Kg，5～7歲，外觀健康。經血清學檢測猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆轉錄D型病毒（SRV）、猴皰疹病毒（Herpes B virus）和猴T淋巴細胞I型病毒（STLV-I）抗體陰性，結核菌素陰性，痢疾菌陰性。動物由廣東康達實驗動物公司繁育并提供動物實驗室，動物許可證證號為SCKX粵2009-0025，并參照美國《實驗動物飼養和使用指南》的相應規范進行管理[7]。實驗獲湖南中醫藥大學倫理委員會審批。

1.1.2藥物HNA-1組由白蔻仁6 g，茵陳15 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，白花蛇舌草15 g，藿香10 g，虎杖15 g，滑石15 g，川木通6 g，薄荷6 g，薏苡仁30 g組成，由湖南中醫藥大學藥學院制劑教研室制備，薄荷提取揮發油用β環糊精包裹，其余藥物與提取后的薄荷水煎、醇沉，制備干膏粉。根據猴/人換算系數3.08估算臨床等效劑量[8]，得出干膏粉與β環糊精包含物的等效劑量分別為0.74 g/kg和5.74 mg/kg。配成水溶液混懸劑，使得每毫升混懸液含干膏粉0.185 g、β環糊精包含物1.44 mg（即5 kg猴灌胃20 mL）。

1.2試劑和儀器

1.2.1試劑DNA提取試劑盒（天跟有限公司）, CD34-PE、CD4-FITC, Dispase II (Roche，終濃度1 mg/mL), Collagenase IV (Invitrogen，終濃度1 mg/mL)和DNase I (Roche，終濃度0.5 mg/mL), SIVmac239毒種由美國P.A. Marx教授惠贈。

1.2.2儀器流式儀（Beckman Coulter）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)；Premix Ex Taq Version2.0、RNAisoTMPlus、SYBR Premix-ExTaq (TaKaRa)；Real-time PCR探針（MBI公司）；C1 000 TM Thermal cycler熒光定量PCR儀。

2方法

2.1動物分組感染

SIVmac239毒種5MID100（5個100％猴感染劑量），1 mL靜脈注射。經用健康中國恒河猴外周血單核細胞體外擴增2代的病毒液，用CEMx174細胞滴定，病毒滴定為105TCID50/mm3。感染時病毒液用雙蒸水1∶50稀釋，靜脈注入1 mL（即200TCID50）。本實驗使用8頭恒河猴感染SIV，為期16～21個月。8頭恒河猴均為本課題其他實驗的模型對照組，感染后未進行過任何藥物干預，其中541為直腸感染，其余均使用靜脈感染。直腸感染方法為：動物禁食40 h，經氯胺酮麻醉后，取膝胸臥位，清潔直腸后，以2.5 mm兒科胃管從肛門插入約8 cm，注入1 mL 含104TCID50SIVmac239的病毒液；并保持該體位20 min。靜脈感染方法為經頭靜脈注射1 mL含200 TCID50的病毒液感染。

2.2分組治療

根據CD4數量對8頭恒河猴分層后，隨機分為對照組和治療組，每組4只。治療組給予HNA-1灌胃治療，每日1次；對照組給予等體積生理鹽水灌胃。兩組均給藥2個月。見表1。

表1　動物感染情況及分組表

2.3 DNA的提取

在不同時間點收集對照組和治療組恒河猴外周血單個核細胞，提取其DNA。DNA提取按照天跟試劑說明書操作。

2.4初始型CD4+T細胞的獲得

處死對照組和HNA-1組的恒河猴，取出胸腺。胸腺細胞的分離采用酶消化法，所用酶為Dispase II、Collagenase IV、和DNase I，37℃消化50 min。離心洗去消化液，提取純化的初始型CD4+T細胞。使用Real-time PCR進行檢測，25 μL反應體系包括：10 μL細胞裂解產物(2.5×104)，0.6μmol/L primers：（正向引物：5’-ATCACTCTGTGTCTAGCT CCCAGC-3’；反向引物：5’-ACTTGCTGAGTTTC ATGATGATT CCTCTA-3’）0.2 μmol/L Taqman探針；FAM-TGCG GG CTC CAT CCT CTC CTG T-TAMRA和ABI Master Mix。循環條件為：50℃，2 min; 95℃, 10 min; 40 cycles of 95℃, 15 s和60℃,1 min，40個循環。同時加入對ccr5基因檢測作為細胞數量均一化的內參，擴增引物為：正向引物：5’-TTC TCT GGA ATC TTC TTC ATC C-3；反向引物：5’- CAA AGG TGA CTG TCC TGG CTT T-3；Taqman探針為：VIC-AAC ACA GCA TGG ACG ATA GCC AGG TAC C-TAMRA。

2.5指標檢測

2.5.1 TRECs的檢測參照Bains I的方法[10]，使用T細胞受體重排刪除環（T cell receptor excision cirles, TRECs）檢測的方法，計算胸腺輸出細胞在初始CD4+T細胞中占的比例。

2.5.2 Ki-67的檢測取106-107待測單個胸腺細胞懸液，CD4分子染色洗滌后，每個流式管加入固定緩沖液100 μL，冰上避光孵育30 min，PBS液洗滌1遍，然后加入穿膜緩沖液300 μL，冰上避光孵育30 min，PBS液洗滌1遍，最后根據每管檢測目的加入Ki-67-APC1 μL，輕輕混勻，置于冰上避光孵育30 min，然后用PBS液洗滌2遍，1 200 r/min離心8 min，棄去上清，用手指彈勻細胞，保證流式管剩余150～200 μL單細胞懸液，上流式細胞儀檢測。

2.5.3 CD34+前體細胞的檢測分離的胸腺細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，1 200 r/min 10 min離心，棄掉上清液，加入適量鼠抗人CD14-FITC、CD3-FITC、CD20-FITC、CD34-PE熒光標記抗體5 μL，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，4％多聚甲醛固定、洗去固定液并PBS重懸后，FACS檢測，計算CD34+Lin-細胞的比例。

2.5.4胸腺細胞發育階段的檢測根據已有的文獻[11]，使用鼠抗人CD45RA（CD45的一種亞型），CD3 (SP34.2)將胸腺細胞（及發育成熟的T細胞）分為CD45RA-CD3dim（II期）、CD45RA-CD3+（III期）和CD45RA+CD3+（IV期）。再進一步用CD69，CD27分群進行檢測分析。流式儀檢測并統計分析胸腺細胞不同發育階段的比例。

2.6統計學分析

3結果

3.1 TRECs的比例改變

TRECs統計分析結果顯示，對照組經線性擬合后TRECs改變倍數明顯呈下降趨勢，其中3只動物降至接近治療前的1/2。HNA-1治療組在經過HNA-1治療后，TRECs改變倍數總體呈明顯的上升趨勢。經重復測量分析，分析T值14.423，P<0.05顯示兩組間差異有統計學意義。同時，由于TRECs的比例會隨著細胞分裂被逐漸稀釋；因此增殖細胞減少可導致TRECs比例相對升高。而本研究同時顯示CD4+T細胞表達Ki67+的比例并未增加，提示HNA-1治療組TRECs比例的增高為胸腺細胞輸出顯著增加。如圖1所示。

注：與對照組相比*P<0.05。圖1　HNA-1治療前、后TRECs（左）及Ki67（右）的改變

3.2胸腺CD34+Lin-細胞的比例

模型對照組和HNA-1組恒河猴胸腺內的細胞經流式檢測，分析比較發現，HNA-1組CD34+Lin-細胞明顯增加，提示SIV慢性感染后經HNA-1治療，胸腺的前體細胞比例明顯增加，分析T值10.699，P<0.01，有統計學意義。見圖2。

注：與對照組相比**P<0.01。圖2　HNA-1治療后胸腺CD34+Lin-細胞的比較柱形圖

3.3不同發育階段胸腺細胞的比例的改變

與模型對照組比較，HNA-1組雙陽性T細胞（Double positive，DP）Ⅱ階段的胸腺細胞比例減少，而DPⅢ和DPⅣ階段的細胞比例均增加。這些研究結果提示，HNA-1治療后可能促進了胸腺細胞從DPⅡ階段發育至DPⅢ和DPⅣ階段。見圖3。

圖3　HNA-1治療后胸腺幼稚淋巴細胞不同發育階段改變的柱形圖

4討論

在前期研究中，發現中藥復方提取物HNA-1能有效增加外周血初始型CD4+T細胞的比例；但CD4+T細胞來源于骨髓還是胸腺并不清楚。在本研究中，首先使用TRECs檢測的方法對胸腺輸出功能進行了評價。TRECs在TCR重排的過程中產生，并在外周組織中的T細胞中穩定存在；它不參與細胞染色體DNA的復制，并隨著細胞分裂被逐代稀釋。本研究發現經HNA-1治療SIV感染恒河猴后，外周血TRECs的比例明顯增加，且隨著HNA-1治療的周數增加而更為顯著；同時細胞增殖并未明顯降低。這提示HNA-1能提升胸腺輸出功能。

在AIDS發病和免疫重建的過程中，胸腺輸出初始型CD4+T細胞起到了重要作用。在感染的前3個月左右[12-13]，以及感染后期[14]，胸腺輸出初始型CD4+T細胞對于維持外周CD4+T細胞庫的穩態起著主要作用。在高效抗逆轉錄病毒治療法(highly active antiretroviral therapy, HAART)治療晚期感染的患者，即使病毒載量被控制在低于檢測水平，也常常由于初始型CD4+T細胞無法恢復而免疫重建失敗。因此，我們發現HNA-1促進胸腺輸出、提高外周血初始型CD4+T細胞比例，可能有重要的臨床價值。

然而，如果HNA-1僅僅只是將未發育成熟的初始型CD4+T細胞動員至外周，有可能一時取得療效，而無法取得持續的療效。因此，本研究進一步對胸腺細胞發育的情況進行了分析。我們發現，HNA-1治療后胸腺CD34+Lin-細胞的比例顯著增加，這表明HNA-1治療能提高骨髓的前體細胞進入胸腺。此外，我們還進一步發現，HNA-1治療促進了胸腺細胞從DPⅡ階段發育至DPⅢ和DPⅣ階段。這就表明，HNA-1不僅僅只是將胸腺細胞動員至外周，而是提高前體細胞比例、促進胸腺細胞分化，是有可能實現持久的療效的。然而，這還需要更進一步的試驗結果證明。

總之，本研究發現，HNA-1治療SIV感染的恒河猴后，通過提高胸腺輸出初始型CD4+T細胞，從而起到維持CD4+T細胞數量、促進免疫重建的作用；且其機制與增高胸腺CD34+細胞的比例、以及促進CD4+T細胞發育密切相關。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of HNA-1 Extracted from a Chinese Medicine Compound on the Thymic Output and Thymocyte Development in Rhesus Macaques with SIV Chronic Infection

WANG Xiaomei1, CHEN Song2, CHEN Yingyu2, HU Yan1, ZHANG Xiaoyu3, NING Xingwang1, ZHU Huibin*
(1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. The Research Institute of Tropical Medicine of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong 510403, China; 3. Department of Surgery, the second People's Hospital of Hunan Province, Changsha, Hunan 410007, China)

Abstract〔〕Objective To investigate the effect of Chinese herbal extract HNA-1 on HIV -1 infection and AIDS. Methods Eight Chinese rhesus macaques had been infected by SIVmac239 for 16 to 21 months were enrolled into this study, the treatment group received HNA -1, control group received normal saline for consecutively 2 months, respectively. In predesigned time-points, peripheral blood were drawn for DNA extraction, and thereby thymic output was evaluated by T-cell receptor excision circle (TRECs) quantification. The thymocyte cells were seperated by enzyme digestion, the proportions of CD34+cells and thymocytes in various development stages were analyzed by flow cytometry. Results Compared with control group, the thymic output function obviously was elevated in HNA-1 group (P<0.05). And the proportion of CD34+Lin-book=7,ebook=10cells was significantly increased (P <0.05). More interestingly, the thymocytes in double positive (DP) stage Ⅱdecreased dramatically, while thymocytes in stage DPⅢand stage DPⅣincreased. Conclusion Enhanced thymic output function may contribute to the effect of HNA-1 on AIDS treatment with underlying mechanisms involving increased thymic progenitor cells and promoted development of thymocytes from stage DPⅡto stage DPⅢ.

Keywords〔〕HNA-1; CD4+T cells; thymic output; thymocyte development

〔通訊作者〕*朱惠斌，女，教授，主任技師，E-mail：1587370309@qq.com。

〔作者簡介〕王小妹，女，檢驗師，主要從事中藥新藥的研究與開發。

〔基金項目〕國家自然科學基金資助項目(81274169)；湖南省高等學校科學研究重點項目(12A102)；湖南省教育廳項目（13C688）；湖南省高校科技創新團隊“感染性疾病中醫藥防治研究”資助項目(NO:15)。

〔收稿日期〕2015-11-03

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.002