止痛健骨方對兔膝骨關節炎模型滑膜及軟骨修復的影響

蘇新平，朱克儉*，譚旭儀

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南長沙410006）

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止痛健骨方對兔膝骨關節炎模型滑膜及軟骨修復的影響

蘇新平1,2，朱克儉2*，譚旭儀2

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南長沙410006）

〔摘要〕目的觀察止痛健骨方對兔膝骨關節炎模型滑膜及軟骨修復的影響。方法建立兔膝骨關節模型，將兔隨機分為正常對照組，模型對照組，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高組共6組，每組6只，止痛健骨低、中、高劑量組分別給予4.48、8.96、17.92 g/kg止痛健骨方灌胃，骨刺寧組給予0.504 g/kg骨刺寧膠囊灌胃，正常對照組、模型對照組給予蒸餾水灌胃，每次10 mL/kg，每日1次，連續給藥4周，檢測各組兔右膝關節屈曲活動度、關節滑膜厚度及軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度，以及膝關節滑膜液炎性細胞，并進行比較。結果實驗4周后，模型對照組較正常對照組膝關節屈曲活動度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度明顯減少，關節滑膜厚度、滑膜液炎性細胞明顯增加（P＜0.05）。與模型對照組比較，止痛健骨低、中、高劑量組膝關節屈曲活動度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度均明顯增加，關節滑膜厚度、滑膜液炎性細胞減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論止痛健骨方能抑制滑膜增生，增加非鈣化軟骨厚度，延緩軟骨退變，增加關節屈曲活動度，這可能是其治療膝骨關節炎的作用機制。

〔關鍵詞〕止痛健骨方；膝骨關節炎；兔；滑膜；軟骨；當歸；白芥子；丹參

止痛健骨方由當歸、白芥子、丹參、乳香、沒藥等12味中藥組成，具有活血祛痰、通絡止痛、強筋健骨的功能，臨床上對膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）具有較好的療效。本文觀察止痛健骨方對KOA滑膜、軟骨等影響，探討其對膝骨關節炎的作用機制，為臨床上治療KOA提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物

成年日本大耳白兔38只，雌雄各半，體質量2.0～2.5 kg，由湖南中醫藥大學實驗動物中心代購，動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.2藥物與試劑

止痛健骨方由湖南省中醫藥研究院中藥所提供，藥物由當歸、白芥子、丹參、豬牙皂、鹿角霜、鱉甲、黃芪、乳香、沒藥、獨活、千年健、陸英12味組成。骨刺寧膠囊（功效為活血化瘀、通絡止通功效，山西忻州市云中制藥廠生產，批號：20000225）。

1.3動物分組及模型制備

將38只白兔按照體質量分層隨機分為正常組7只，模型組31只。模型組白兔參照關節制動制作骨關節炎動物模型方法[1]，采用石膏將兔右后膝關節伸直位固定，6周后在正常組、模型組各隨機選擇1只白兔，處死，打開右膝關節，驗證模型組白兔右后膝骨關節炎模型制備成功。此時將模型組剩余的30只白兔隨機分為模型對照組，骨刺寧組，止痛健骨低、中、止痛健骨高劑量組共5組，每組6只，正常對照組為之前正常組剩余的6只白兔。

1.4藥物干預

根據兔與人體表面積方法[2]，計算得出止痛健骨低、中、高劑量組分別給予止痛健骨方4.48、8.96、17.92 g/kg灌胃（分別相當于人臨床等效劑量的1、2、4倍）。骨刺寧組給予骨刺寧膠囊0.504 g/kg灌胃（相當于人臨床等效劑量的2倍），正常對照組、模型對照組給予蒸餾水灌胃，10 mL/kg。每日給藥1次，連續給藥4周。

1.5觀察指標及方法

1.5.1右膝關節屈曲活動度各組白兔在造模6周后（即實驗干預前）、實驗干預4周后采用雙臂式量角器測量右膝關節活動度，方法如下：以雙臂式量角器測定軸心對準關節中心點，兩臂對準肢段軸線，膝關節伸直位為0°。

1.5.2膝關節滑膜厚度及軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度實驗干預4周后，耳緣靜脈空氣栓塞處死全部動物，立即打開各組白兔右后膝關節腔，用螺旋測微器測定關節滑膜厚度，然后將切取軟骨作HE染色區別鈣化與未鈣化部分，并分別測量其厚度，計算軟骨未鈣化厚度與鈣化厚度的比值。

1.5.3膝關節滑膜液炎性細胞提取右后膝關節滑膜液涂片計數炎性細胞，光鏡下觀察記錄。每張涂片隨機觀察5個HP（10×40倍）視野，計算每一視野平均炎性細胞數。計數標準：細胞數為0個/HP為“-”，細胞數<10個/HP為“+”，10～20個細胞/HP“++”，細胞數>20個/HP為“+++”。

1.6統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對實驗數據進行分析，計量資料滿足方差齊性和正態齊性時，組間比較采用單因素方差分析（LSD法），組內治療前后比較采用配對t檢驗，多組間等級資料采用Kruskal-wallis H檢驗，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組右膝關節屈曲活動度比較

各組白兔均完成了4周時間的實驗干預，實驗期間無死亡。在實驗干預前對各組白兔右后膝關節屈曲活動度進行測量，模型對照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組分別與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示兔膝骨關節炎模型活動度較正常減少。實驗干預4周后，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較干預前有增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而正常對照組、模型對照組無明顯變化（P＞0.05）。實驗干預后組間比較，骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組分別與模型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示經止痛健骨方干預后，右膝關節屈曲活動度得到明顯增加，見表1。

2.2各組右膝關節關節滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較結果

實驗干預4周后，與正常對照組比較，模型對照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組關節滑膜厚度有明顯增加，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度有減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較模型對照組比較，關節滑膜厚度有減少，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度有增加（P＜0.01）。與骨刺寧組比較，止痛健骨低、中劑量組在該兩項指標無明顯差異（P＞0.05），但止痛健骨高劑量組有統計學差異（P＜0.01），表明止痛健骨方對兔KOA模型滑膜厚度腫脹有抑制作用，能增加軟骨未鈣化與鈣化厚度的比值，見表2。

表1　各組右膝關節屈曲活動度比較　（±s，n=6）

表1　各組右膝關節屈曲活動度比較　（±s，n=6）

注：干預前，與正常對照組比較，#P＜0.05，模型對照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組五組兩兩互相比較，P＞0.05；干預后，與正常對照組比較，△P＜0.05，與模型對照組比較，▲P＜0.05，止痛健骨低、中、高劑量組三組兩兩互相比較，P=0.000。組內干預前后比較，☆P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組骨刺寧組止痛健骨低劑量組止痛健骨中劑量組止痛健骨高劑量組F值P值劑量（g/Kg）0.504 4.48 8.96 17.92干預前（°）145.61±5.3 101.72±6.1#102.52±5.8#103.05±5.9#102.41±6.0#101.95±5.4#576.883 ＜0.01干預后（°）146.13±4.9 101.92±8.6△120.48±10.3△▲☆119.70±10.4△▲☆126.85±10.0△▲☆130.24±8.9△▲☆562.818 ＜0.01 t值P值-0.925 -1.012 31.240 29.547 33.876 52.268 0.623 0.571 0.000 0.000 0.000 0.000

表2　各組右膝關節關節滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較　　（±s，n=6）

表2　各組右膝關節關節滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較　　（±s，n=6）

注：與正常對照組比較，#P=0.000；與模型對照組比較，*P=0.000；與骨刺寧組比較，▲P＜0.05。

組別　劑量（g/Kg）正常對照組模型對照組骨刺寧組止痛健骨低劑量組止痛健骨中劑量組止痛健骨高劑量組F值P值0.504 4.48 8.96 17.92關節滑膜厚度（mm）1.03±0.07 1.54±0.12#1.22±0.09#* 1.23±0.03#* 1.24±0.10#* 1.18±0.03#*▲85.499 ＜0.01軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度8.32±0.73 5.11±0.64#7.88±0.78#* 7.85±0.79#* 7.86±0.85#* 8.11±0.81#*▲104.211 ＜0.01

2.3各組右膝關節關節滑膜液炎性細胞計數比較

實驗干預4周后，各組右膝關節滑膜液炎性細胞計數，模型對照組較正常對照組滑膜液炎性細胞明顯增加，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較模型對照組明顯減少（P＜0.05），表明止痛健骨方能較好緩解兔KOA模型膝關節滑膜的炎性癥狀，見表3。

表3　各組右膝關節關節滑膜液炎性細胞計數比較　（n=6）

3討論

KOA主要臨床表現為膝關節部位疼痛、活動不利等，好發于中老年人，對日常生活與活動有較大影響[3-4]。隨著我國社會老齡化進程加快，本病的發病率逐年上升[5]。有關中醫藥治療本病的研究與臨床觀察報道也較多。一般認為，中醫藥治療骨性關節炎療效與西醫相比副作用少而療效鞏固，因此國內外市場也對治療本病的中醫藥產品有較好的認同[6]。

有關KOA的具體發病機制仍未完全明了，實驗研究發現本病主要病理特點是軟骨退變、破壞，并伴關節滑膜增生，這在人體和動物實驗中均得到可靠證實。在KOA軟骨病理切片中，非鈣化軟骨厚度下降，鈣化軟骨厚度反而增加，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比值下降[7]。中醫學中并無KOA病名，但根據其癥狀特點，將KOA歸屬“膝痹”范疇[8]，如《素問·脈要精微論》云：“膝者，筋之府，屈伸不能，行則僂附，筋將憊矣。”本病日久不愈，常有關節腫脹、積液之癥，更為痰瘀阻絡，其舌質暗或有瘀斑、瘀點，舌苔滑或膩等皆為痰瘀之證。由此可見，痰瘀阻絡，肝腎虧虛，屬本虛標實之證[9]。正如《丹溪心法》云：“肥人肢節痛，多是風濕與痰飲流注經絡而痛。”因此，對本病的治療，應痰瘀兼顧。

為探討止痛健骨方對KOA的作用機制，本課題在成功制備兔KOA模型基礎，觀察其對兔KOA模型滑膜及軟骨修復的影響。該方原系湖南省民間以補腎活血為主要功能治療骨質增生癥的經驗方，經湖南省中醫藥研究院朱克儉教授根據其臨床經驗及對骨關節炎病因病機、證候辨治特點，從痰瘀阻絡，兼肝腎不足立法，對處方用藥進行了較大調整，臨床應用于治療腰、膝等多部位骨性關節炎多年，通過初步臨床觀察，提示該方有止痛作用顯著且見效較快、作用較為持久等特點。方中以當歸活血祛瘀，通絡止痛，白芥子豁痰通經、消腫止痛，二味共為君藥；方中丹參活血祛瘀止痛，用之以加強當歸活血通絡止痛功能；豬牙皂通竅滌痰，用之以加強白芥子祛痰通經的功能；鹿角霜補肝腎以強筋骨，兼顧其本虛。以上三味為臣藥。方中鱉甲滋補肝腎，通絡散結。用之佐助君臣藥肝腎、強筋骨，且通絡而止痛；黃芪健脾而資氣血生化之源，用以補虛損而佐助行血氣、強筋骨；乳香、沒藥二藥并用，凡心胃脅腹肢體關節諸疼痛皆能治之，二味進一步增強全方行血通絡止痛效果；獨活、千年健、陸英功能通經絡，消腫痛。七藥皆能佐助君臣藥改善癥狀，故以為佐藥。全方合用，共奏活血祛痰，通絡止痛，強筋健骨之效，故對骨性關節炎痰瘀阻絡兼肝腎不足所致腰膝酸脹疼痛、乏力，關節腫脹麻木，活動不利等癥有效。

現代藥理學研究發現，方中藥物具有多種藥理效應，如抗血小板聚集、抗炎、鎮痛、增強機體免疫力等作用[10-12]。本實驗結果提示，止痛健骨方能抑制滑膜增生和炎癥癥狀，增加非鈣化軟骨厚度，延緩軟骨退變，增加關節屈曲活動度，且隨著止痛健骨劑量的增加，各指標改善明顯，這可能是其治療KOA的作用機制。然止痛健骨方通過何種信號通路達到對KOA的作用，有待下階段進一步研究。

參考文獻：

[1]張洪，江捍平，王大平.關節制動制作骨性關節炎動物模型的探討[J].中國現代醫學雜志，2006，16(12)：1 843-1 844.

[2]魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學·第四版[J].北京：人民衛生出版社，2010：1 698.

[3]中華醫學會骨科分會.骨關節炎診治指南（2007年版）[J].中華骨科雜志,2007,27(10):793-795.

[4] Silva FS, Melo FE, Amaral MM, et al. Efficacy of simple integrated group rehabilitation program for patients with knee osteoarthritis: Single-blind randomized controlled trial[J]. J Rehabil Res Dev，2015，52(3)：309-22.

[5]高仰賢,江蓉星.骨性關節炎發病機制的國內研究進展[J].中醫正骨,2005,17(4):55-57.

[6]徐穎鵬，謝利民，王文岳.中藥外治與西藥治療膝骨關節炎療效及安全性Meta分析[J].中國中藥雜志，2012，37（19）：2 977-2 984.

[7]白希壯，王星鐸.實驗性骨關節炎中關節軟骨鈣化層厚度測定及其意義[J].中華骨科雜志，1996，16（1）：40-43.

[8]唐皓，蔣盛昶，陳堅，等.紅外熱成像技術在膝關節骨性關節炎中醫證型診斷中的意義[J].湖南中醫藥大學學報，2015,35（2）：43-45,48.

[9]龔志賢，譚旭儀，盧敏.小針刀配合針灸辨證治療膝骨性關節炎的臨床觀察[J].湖南中醫藥大學學報，2011,31（1）：69-72.

[10]劉如秀，劉宇，汪艷麗，等.當歸的藥理作用[J].西部中醫藥，2014，27（11）：153-156.

[11]王煒辰，吳學輝，鄭芳.丹參藥理學研究進展[J].海峽藥學，2013，25（10）：24-25.

[12]范莉，李林，何慧鳳.獨活揮發油抗炎、鎮痛藥理作用的研究[J].安徽醫藥，2009，13（2）：133-134.

（本文編輯楊瑛）

Effects of Zhitong Jiangu Decoction on Synovial and Cartilage Repair in Rabbit Models of Knee Oosteoarthritis

SU Xinping1,2, ZHU Kejian2*, TAN Xuyi2
(1.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410006, China)

Abstract〔〕Objective To observe the effect of Zhitong Jiangu decoction on synovial and cartilage repair in rabbit models of knee osteoarthritis. Methods The rabbits were randomly divided into normal control group, model control group, Gucining group, and low, medium and high dose of Zhitong Jiangu groups, six rabbits in each group, after rabbit models of knee osteoarthritis were successfully established. Rabbits of low, middle, high dose of Zhitong Jiangu were given 4.48, 8.96 17.92 g/kg Zhitong Jiangu decoction, respectively. Gucining group was given 0.504 g/kg Gucining capsule, while normal control group and model control group were given 10 mL/kg distilled water for once per day, continuously administration for 4 weeks. Then right knee flexion mobility, synovium thickness and ratio of noncalcified cartilage with calcified, and synovial fluid inflammatory cells were observed and compared. Results After 4 weeks, compared with normal control group, the right knee flexion mobility and ratio of noncalcified cartilage with calcified of the model control group was decreased, while its synovium thickness and synovial fluid inflammatory cells was increased (P＜0.05). Compared with model control group, the knee flexion mobility and ratio of noncalcified cartilage with calcified of Zhitong JianGu groups were increased, while their synovium thickness and synovial fluid inflammatory cells were decreased, the diffrences were statistically significant (P＜0.05). Conclusion Zhitong Jiangu decoction could inhibit the synovium hyperplasia, thicken noncalcified cartilage, delay cartilage degeneration and increase knee flexion mobility, it may be a mechanism for the treatment of knee osteoarthritis.

Keywords〔〕Zhitong Jiangu decoction；knee osteoarthritis；rabbits；synovium；cartilage；Angelica sinensis；mustard；Salvia miltiorrhiza

〔通訊作者〕*朱克儉，男，博士研究生導師，E-mail：zkjo0731@263.net。

〔作者簡介〕蘇新平，男，主任醫師，在讀博士研究生，主要從事骨關節病研究。

〔基金項目〕湖南省中醫藥科研基金資助項目（2008035）。

〔收稿日期〕2015-09-28

〔中圖分類號〕R285.5；R681

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.003