艾灸、電針預處理對急性胃黏膜損傷大鼠TGF-α、PCNA的影響

郭禮娜，劉薇薇，譚成富，潘思安，劉　密*，王　超，常小榮

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南長沙410208）

?

艾灸、電針預處理對急性胃黏膜損傷大鼠TGF-α、PCNA的影響

郭禮娜，劉薇薇，譚成富，潘思安，劉密*，王超，常小榮

（湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南長沙410208）

〔摘要〕目的對比觀察艾灸預處理和電針預處理兩種不同方法對急性胃黏膜損傷大鼠轉化生長因子（TGF-α）和增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響差異。方法將40只SPF級的SD大鼠隨機的分為4組（空白組、模型組、艾灸預處理組和電針預處理組），艾灸預處理組和電針預處理組選取“足三里穴”、“中脘穴”分別行艾灸和電針預處理8 d后，除空白組外造模，選用無水乙醇灌胃的方法（0.5 mL/100 g）制成大鼠急性胃黏膜損傷模型。造模1 h后，用20％烏拉坦（0.6 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉，再取材。在光鏡下觀察大鼠的胃黏膜組織形態學的改變，免疫組化法檢測胃黏膜TGF-α、PCNA的表達。結果與空白組相比較，模型組胃黏膜中TGF-α、PCNA的表達明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比較，艾灸預處理組和電針預處理組胃黏膜中TGF-α、PCNA的表達均有不同程度升高（P<0.05或P<0.01）;與艾灸預處理組相比較，電針預處理組胃黏膜中TGF-α的表達明顯降低，具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），而胃黏膜中PCNA的表達則無明顯差異（P>0.05）。結論艾灸預處理與電針預處理均可以減輕無水乙醇對胃黏膜造成的損傷，促進胃黏膜保護因子（TGF-α、PCNA）的表達，但艾灸預處理稍優于電針預處理。

〔關鍵詞〕急性胃黏膜損傷；電針；艾灸；預處理；TGF-α；PCNA

急性胃黏膜損傷（Acute Gastric Mucosal lesions, AGML）是指以胃黏膜產生不同程度的潰瘍、糜爛和出血等為特點的病變，其病因主要包括酒精中毒以及非甾醇類抗炎藥如阿司匹林等。急性胃黏膜損傷的修復主要是經過損傷后早期重建以及細胞增生。目前實驗研究均已證明，許多生長因子和細胞因子都參與了胃黏膜上皮損傷的修復調節，如轉化生長因子α（trasforming growth factor-α, TGF-α）可以促進胃黏膜上皮細胞遷移和增殖。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是反映細胞增殖狀態的直接衡量指標。大量的實驗研究和臨床實踐已證明，艾灸和電針均對胃黏膜具有很好的保護作用，不僅可以改善患者臨床癥狀，還可以促進潰瘍組織的愈合[1-3]。本實驗旨在探討艾灸預處理和電針預處理兩種不同干預方法對胃黏膜預防保護作用是否相同，或各有特點。

1材料與方法

1.1動物與分組

SPF級SD大鼠40只，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK (湘)2011-0003。飼養溫度20～25℃，濕度50％～70％，體質量200～220 g，雌雄各半。隨機分為4組，空白組、模型組、艾灸預處理組、電針預處理組。實驗程序經湖南中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器

20％烏拉坦（上?；瘜W試劑公司）；4％多聚甲醛溶液（湖南中醫藥大學免疫組化實驗室配置）；枸櫞酸鹽緩沖液、蘇木素（Wellbio）。華佗牌1寸毫針（杭州丹頓醫療器械有限公司）；SDZ-V型華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品有限公司）；溫灸純艾條（南陽市臥龍漢醫艾絨廠,規格4 mm×120 mm，10支/盒）；簡易艾灸架、隔熱薄膜、電阻溫度測定儀(自制)；TGL-16臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；THZ-C恒溫振蕩器（太倉市強樂實驗設備有限公司）；OLYMPUS Bx -70顯微鏡成像系統(OLYMPUS公司)；TS-92搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）；YD-315切片機（浙江金華益迪試驗器材）；BMJ-A包埋機（常州中威電子儀器）；BA21OT顯微鏡（Motic）。

1.3造模方法

選用無水乙醇灌胃的方法制備大鼠急性胃黏膜損模型。需造模的各組大鼠于實驗第8天預處理后禁食不禁水24 h，再每只大鼠采用灌胃針灌服無水乙醇（0.5 mL/100 g），造模時間為1 h。而空白組大鼠用灌胃針灌服生理鹽水（0.5 mL/100 g），時間為1 h，再麻醉取材。

1.4穴位定位和處理方法

1.4.1穴位定位參考李忠仁主編《實驗針灸學》常用動物穴位定位法及擬人對照法定位，足三里穴（后三里穴）處于實驗大鼠膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處。中脘穴處于大鼠臍上約20 mm(以胸鎖聯合和恥骨聯合連線下1/4與上3/4交點為大鼠肚臍)。

1.4.2處理方法空白組和模型組大鼠每天捆綁固定在鼠板上30 min，連續捆綁8 d；艾灸預處理組大鼠每天捆綁固定于鼠板上后，選取大鼠雙側足三里穴和中脘穴，并將艾條固定在自制的簡便灸架上，同時對準各施灸穴位，距離約2 cm處點燃施灸，用電阻溫度測定儀(自制)測量大鼠體表溫度，其體表溫度大約達到42℃，每天持續灸30 min，1次/d，連續8 d。電針預處理組大鼠行同樣的固定、同時選取雙側的足三里穴和中脘穴，將毫針直刺入穴位大約3 mm后，采用提插捻轉（平補平瀉）的手法1 min，然后連接SDZ-V型華佗牌電針治療儀，波形選用疏密波（疏波與密波頻率之比為10/50 Hz），其刺激強度為2 mA（以上肢輕微顫抖為度），時間持續為30 min，1次/d，連續治療8 d。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1胃黏膜組織形態學觀察在胃黏膜損傷最嚴重處取1小塊(約0.5 cm×1 cm)，用冰生理鹽水沖洗干凈，放入4％多聚甲醛中固定24～48 h,常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋,間斷連續切片(厚度4 μm)、烤片、常規脫蠟;光鏡下觀察胃黏膜組織形態學改變。

1.5.2胃黏膜PCNA、TGF-α檢測（免疫組化法）在胃黏膜損傷明顯處選取1.0 cm×0.5 cm組織塊，用冷生理鹽水清洗，濾紙吸干，將其裝入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含4％多聚甲酸、0.05％戊二酸和15％飽和苦味酸、pH 7.4)中室溫下固定待檢。石錯包埋后連續切片，60℃烤片30～60 min；切片脫蠟至水；將切片浸入到0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）當中，用微波爐或電爐加熱到沸騰后再斷電，大約間隔5～10 min后，重復1～2次。冷卻后0.01M PBS（pH 7.2～7.6）清洗3 min，重復清洗3次；加入3％H2O2，室溫放置10 min以便滅活內源性酶。PBS清洗3 min，重復清洗3次；再滴加適當稀釋過的一抗，37℃放置1～2 h或4℃過夜。用PBS清洗5 min，重復清洗3次；滴加50～100 μL抗兔/鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃下孵育30 min，再用PBS清洗5 min，重復清洗3次；配置DAB溶液顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復染，各級酒精60％～100％脫水，取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。數據分析采像為普通電腦采像；圖像分析軟件是IPP（Image-Pro-Plus）進行平均光密度的分析。結果判斷：陽性染色為黃色或棕黃色染色。

1.6統計學分析

2結果

2.1各組胃黏膜光鏡下觀察

光鏡下,空白組(圖1-A)可見胃黏膜上皮結構連續完整，細胞排列整齊，細胞核和細胞質輪廓清晰可見，未見明顯胃黏膜損害;與空白組比較,模型組(圖1-B)大鼠胃黏膜結構明顯破壞，胃腺細胞大量壞死,雜亂無序，細胞內充血并水腫，可見明顯胃黏膜損傷;與模型組相比較,艾灸預處理組(圖1-C)和電針預處理組(圖1-D)大鼠胃黏膜表面細胞相對而言比較完整，細胞核與細胞質結構均比較清晰，胃黏膜的表面有少許脫落,胃黏膜破損情況較模型組明顯改善,說明艾灸和電針預處理可以有效預防無水乙醇對正常大鼠導致的胃黏膜損傷。

圖1　各組胃黏膜光鏡下觀察圖（×100）

2.2艾灸預處理和電針預處理對AJML大鼠胃黏膜中TGF-α、PCNA的影響

與空白組相比較，模型組胃黏膜TGF-α、PCNA的表達顯著升高（P<0.05或P<0.01），說明無水乙醇造模后可以使胃黏膜出現增殖修復反應；與模型組相比較，艾灸預處理組和電針預處理組胃黏膜TGF-α、PCNA的表達顯著升高（P<0.05或P<0.01），說明艾灸預處理和電針預處理能夠提高胃黏膜增殖修復能力。與艾灸預處理組相比較，電針預處理組胃黏膜TGF-α的表達顯著降低（P<0.01），而胃黏膜中PCNA的表達未見明顯差異（P>0.05），說明艾灸預處理對胃黏膜的增殖修復能力優于電針預處理組。見表1。

表1　各組胃黏膜TGF-α、PCNA表達的比較?。╪=10,±s）

表1　各組胃黏膜TGF-α、PCNA表達的比較?。╪=10,±s）

注：與空白組相比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與艾灸預處理組相比較▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組艾灸預處理組電針預處理組F值P值TGF-α 0.006±0.02 0.011±0.002* 0.025±0.003**△△0.014±0.003**△△▲▲PCNA 0.021±0.010 0.036±0.014* 0.054±0.010**△0.0527±0.012**△106.70 0.00 17.41 0.00

3討論

TGF-α是EGF家族中參與胃黏膜損傷之后修復的主要調節肽之一。在胃腸道當中，TGF-α尤以胃竇黏膜中表達量為最高，是胃體黏膜的3倍，它不僅參與了黏膜上皮的更新，還介入了黏膜損傷后的修復，并且它是保持黏膜完整性的重要物質，且對多種細胞有促進有絲分裂功用，如上皮細胞、內皮細胞、纖維細胞以及黏膜組織等[4]。研究表明TGF-α可能作為黏膜保護因子，在胃黏膜損傷相關疾病中發揮黏膜修復及保護作用，它可以促進細胞增殖、抑制胃酸分泌、降低潰瘍指數、加速潰瘍的愈合[5]。PCNA是由Miyahci等在1978年從系統性紅斑狼瘡病患的血清當中發現的，因它存在于增殖性細胞中而得名。實驗研究表明，PCNA與細胞的DNA合成有密切的關系，在啟動細胞增殖上具有重要作用。PCNA是一種細胞周期調控蛋白，它反映了細胞增殖率及DNA合成率，近年來被普遍的應用于胃黏膜增殖活性的研究當中[6-7]。

電針療法是指將毫針刺入人體腧穴后，將電針機連接到毫針上，在通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法，有止痛、鎮靜、促進氣血循環等功效。而艾灸療法是用艾葉為主要灸料，借灸火的熱力功用，經過經絡腧穴的作用，起到防治疾病的一種治法，具有溫經散寒、行氣通絡等作用。“針灸預處理”是指預先用針灸的手段在機體的穴位上進行刺激，以增強機體的抗病與應變能力，并起到抑制或減弱隨后疾病對機體組織器官損傷的功用，是“治未病”現代運用的方式之一。針灸“治未病”實踐的積累和機制的研究使其獲得了較高的社會認可程度，且其適應面廣、簡便安全、較為經濟。因此運用針灸防治胃黏膜損傷相關疾病的發生、發展具有一定的臨床價值。電針和灸法的治療作用具有相似性，但又有差別。古有“灸治百病”之說，艾灸在“治未病”和防治胃黏膜損傷相關疾病獨具優勢。艾灸相對電針而言，操作更方便，適用性更廣。對于暈針、懼針人來講，艾灸的選擇性更好，更易被人接受。目前關于艾灸預處理對急性胃黏膜損傷的預保護作用的實驗研究較多，然而關于電針預處理對急性胃黏膜損傷的預保護作用的研究較少，而關于艾灸預處理和電針預處理之間對于急性胃黏膜損傷的保護作用機制的差異性研究亦鮮有報道。本課題組前期研究大多是關于艾灸預處理對胃黏膜損傷的預保護，它可以通過調整細胞的多種因子、清除氧自由基、抑制炎性細胞因子等，來減輕胃黏膜損傷的程度而達到保護胃黏膜的作用[8-12]。本實驗在前期研究的基礎上，對比了艾灸預處理與電針預處理對大鼠急性胃黏膜損傷胃組織形態學和胃黏膜保護因子（TGF-α、PCNA）的差異，探討電針預處理對急性胃粘膜損傷的預保護作用，及艾灸預處理與電針預處理對胃黏膜保護功用是否有差別。實驗結果顯示：艾灸預處理與電針預處理可有效的減輕無水乙醇對大鼠胃黏膜組織的損傷，并且可以促進胃黏膜中TGF-α、PCNA表達的升高，且艾灸預處理對胃黏膜中TGF-α表達的升高高于電針預處理。表明艾灸預處理和電針預處理可以促進胃黏膜增殖修復因子（TGF-α、PCNA）的合成和分泌，啟動胃黏膜修復機制，從而加強胃黏膜細胞增殖作用。但艾灸預處理的修復作用可能優于電針預處理。其具體差異可能與其刺激方式不同有關，有待更進一步研究。

參考文獻：

[1]徐國林,于翠華,王大志.辨證施灸治療胃痛30例[J].中醫外治雜志,2005,14(2):44-44.

[2]胡敏.電針加隔姜灸治療寒邪客胃型胃痛68例[J].成都中醫藥大學學報,2010,33(2): 23-24.

[3]唐潤霞.針灸治療胃脘痛50例療效觀察[J].河南中醫學院學報, 2005,20(3):59-59.

[4] Playford RJ. Peptides and gastrointestinal mucosal integrity. Gut, 1995;37:595-597.

[5] Yetkin G, Celebi N, Ozer C, et al. The healing effect of TGF-alpha on gastric ulcer induced by acetylsalicylic acid in rats[J]. Int J Pharm, 2004，277(1-2):163-172.

[6] Muskhelishvili L, Latendresse JR, Kodell RL, Hen derson EB. Evaluation of cell proliferation in rat tissues with BrdU, PCNA,Ki -67 (MIB -5) immunohistochemistry and in situhybridization for histonemRNA [J]. J Histochem Cytochem, 2003, 51 (12):1 681-1 688.

[7]李鐵浪，粟艷梅，祁芳，等.艾灸對脾虛胃潰瘍模型大鼠血清TFF及胃黏膜ERK1/2、PCNA的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2015，35（2）：49-55.

[8]常小榮,彭娜,易受鄉,等.艾灸預處理對應激性潰瘍大鼠胃黏膜HSP70蛋白及mRNA表達的影響[J].世界華人消化雜志，2006,14 (13):1 252-1 256.

[9]劉密,常小榮,嚴潔,等.艾灸對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜表皮生長因子、轉化生長因子-α及其受體的影響[J].針刺研究,2011,36(6): 403-408.

[10]劉密,常小榮,嚴潔,等.艾灸預處理對大鼠應激性胃黏膜損傷增殖修復相關因子的影響[J].世界華人消化雜志,2012,20(1): 53-59.

[11]劉密,常小榮,嚴潔,等.艾灸預處理對大鼠應激性胃黏膜損傷的保護作用[J].中華中醫藥雜志,2012,27(1):58-62.

[12]劉密,常小榮,嚴潔,等.艾灸預處理對應激性胃黏膜損傷大鼠血清IL-1β,TNF-α和IL-10的影響[J].中國中醫急癥,2011,20 (6):906-908.

（本文編輯匡靜之）

·臨床研究·

Effects of the Moxibustion and Acupuncture Preconditioning on TGF-α and PCNA of Rats with Acute Gastric Mucosal Lesions

GUO Lina, LIU Weiwei, TAN Chengfu, PAN Sian, LIU Mi*, WANG Chao, CHANG Xiaorong
(Acupuncture and Massage College of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China)

Abstract〔〕Objective To observe the effects of the moxibustion preconditioning and acupuncture preconditioning on TGF-α and PCNA in rabbits with acute gastric mucosal lesions. Methods 40 SPF-class SD rats were randomly divided into four groups: blank group, model group, moxibustion preconditioning group and electroacupuncture preconditioning (EA) group. The moxibustion preconditioning group and EA group were pretreatmented at "Zusanli point" and "Zhongwan point" for 8 days. The model of rats with acute gastric mucosal lesions was established by absolute ethanol irrigation (0.5 mL/loog). After 1 hour of modeling, the rats were anesthetized by 20％ urethane (0.6 mL/100 g), and then fetch gastric tissue. Histomorphology changes of gastric mucosa in rats were observed by light microscopy. The expression of PCNA and TGF-α was detected by immunohistochemistry method. Results Compared with blank group, the expression of TGF-α and PCNA were increased (P <0.05 or P <0.01). Compared with model group, the expression of TGF -α and PCNA in moxibustion preconditioning and EA groups was increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with moxibustion preconditioning group, the expression of TGF -α in EA group was decreased obviously (P <0.05 or P <0.01)，but the expression of PCNA has nobook=46,ebook=49significant difference (P>0.05). Conclusion Moxibustion and EA pretreatment can reduce the damage caused by ethanol on gastric mucosa, and promote the expression of gastric mucosal protective factor (TGF-α, PCNA), but moxibustion is better than that of EA pretreatment .

Keywords〔〕acute gastric mucosal lesions; electroacupuncture; moxibustion; preconditioning; TGF-α; PCNA

〔通訊作者〕*劉密，男，副教授，E-mail:newmean9722@qq.com。

〔作者簡介〕郭禮娜，女，在讀碩士研究生，研究方向：針灸治病機制的研究。

〔基金項目〕國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2015CB554502）；國家自然科學基金項目（81202770, 81574082）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類課題（20124323120002）；湖南省自然科學基金項目（13JJ6060）；湖南省優秀博士學位論文獲獎作者科研項目（YB2013B037）；湖南省教育廳資助科研項目（14B129）；2013年湖湘青年科技創新創業平臺項目；2013年湖南省高層次衛生人才“225”工程培養項目資助。

〔收稿日期〕2015-12-15

〔中圖分類號〕R245；R256.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.012