環氧合酶2通過上皮間質轉換促進胃癌的侵襲與轉移

李 靜，孫保存，2，孫 冉，趙秀蘭，2，董學易，2，趙 楠，2，古 強，2，張丹芳，2，劉鐵菊，2

（1.天津醫科大學病理學教研室，天津300070；2.天津醫科大學總醫院病理科，天津300052；3.天津市南開醫院外科，天津300100）

論著

環氧合酶2通過上皮間質轉換促進胃癌的侵襲與轉移

李 靜1，孫保存1，2，孫 冉3，趙秀蘭1，2，董學易1，2，趙 楠1，2，古 強1，2，張丹芳1，2，劉鐵菊1，2

（1.天津醫科大學病理學教研室，天津300070；2.天津醫科大學總醫院病理科，天津300052；3.天津市南開醫院外科，天津300100）

目的：探討環氧合酶2（COX-2）及Snail在胃癌組織中的表達及臨床意義，研究COX-2轉染對人胃癌細胞侵襲遷移能力的影響并探討其機制。方法：免疫組化檢測COX-2及Snail在100例胃癌組織中的表達情況，分析其與臨床資料的關系；篩選構建COX-2穩定表達的MKN74、MKN45細胞系；觀察轉染前后細胞的形態、功能及相關蛋白的改變。結果：COX-2的表達與遠處轉移、淋巴結轉移、不良預后密切相關（P＜0.05）；Snail的表達與分期、淋巴結轉移、遠處轉移相關（P＜0.05）；COX-2的表達與Snail之間存在相關性（P＜0.01）。與對照組相比，MKN74/COX-2細胞形態呈現EMT形態學改變，E-cadherin表達下調、Vimentin表達上調，遷移侵襲能力明顯增強；MKN45/shCOX-2細胞形態由長梭形變為鋪路石樣，E-cadherin表達上調、Vimentin表達下調，遷移侵襲能力減弱。結論：COX-2可以通過EMT促進胃癌細胞的侵襲和轉移。

胃癌；環氧合酶2；上皮間質轉換；細胞遷移；細胞侵襲

胃癌是我國常見的消化道腫瘤，臨床就診時大都已屬于中晚期，術后5年生存率在20%左右，而腫瘤的侵襲和轉移是導致患者預后較差的重要原因。環氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是前列腺素合成過程中的一個重要的限速酶，其有兩種同工酶：COX-1和COX-2。COX-1屬于管家酶，主要存在于人正常組織中，催化產生前列腺素E2，在調節外周血管阻力、維持腎臟和胃的正常功能中起重要作用，COX-1不存在于炎癥部位。COX-2是誘導酶，在正常生理狀態下幾乎不表達或很少表達，在各種炎癥因子、腫瘤因子的刺激下迅速產生，并且在炎癥演變成腫瘤的過程中扮演著重要角色[1]。流行病學研究表明，規律且長期的服用COX-2抑制劑減少了結腸癌的發病率，進一步的研究發現COX-2的表達與多種腫瘤的發生都有密切的關系[2-3]。為了探討COX-2在胃癌中的表達及其與胃癌細胞生物學行為的關系，本研究采用免疫組化檢測胃癌組織中COX-2、Snail的表達與臨床病理資料的關系，并利用細胞實驗進一步闡釋了COX-2促進胃癌細胞侵襲和轉移的相關機制，為采用COX-2抑制劑應用于胃癌的預防與臨床治療提供借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 選取天津醫科大學腫瘤醫院和天津醫科大學總醫院2004-2008年經手術切除隨訪資料完整的100例胃癌患者的癌組織標本作為研究對象，100例胃癌患者年齡為31~82歲，其中男性69例，女性31例。腫瘤最大者為20cm×6cm×3cm，最小者1 cm×1 cm×0.8 cm。根據Lauren分型將胃癌組織分為腸型和彌漫型，其中腸型52例（52%），彌漫型48例（48%）。根據國際抗癌聯盟、美國癌癥聯合委員會（UICC/AJCC）2010年分期標準，將胃癌組織分為Ⅳ期，其中Ⅰ/Ⅱ期51例（51%），Ⅲ/Ⅳ期49例（49%）。入組患者術前均未接受化療和放療。

1.1.2 細胞株 人胃癌細胞株MKN74購于廣州吉妮歐有限公司；人胃癌細胞MKN45購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫，人腎癌293T細胞株由天津醫科大學病理實驗室自存。

1.1.3 實驗試劑 DMED購自美國Neuronbc公司，胎牛血清購自Ggibco公司。PReceiver-Lv/COX-2慢病毒表達載體購自GeneCopoeia公司；Transwell小室購自FALCON公司。羊抗人多克隆抗體COX-2、兔抗山羊IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。兔抗人多克隆抗體Snail、兔抗人單克隆抗體E-cadherin、兔抗人單克隆抗體Vimentin均購自美國Abcom公司。兔抗人單克隆抗體β-actin購自美國SantaCruz公司，PCR引物購自中國廣州復能基因公司，RNA提取試劑Trizol、反轉錄試劑盒、PCR反應試劑盒均購自北京Tiangen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色 胃癌組織石蠟包塊4 μm連續切片；脫蠟水化后3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復10 min，血清封閉液室溫下封閉30 min，滴加一抗，4℃過夜，次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木復染核，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。采用Mattern[4]積分法評定染色結果：每例標本選擇10個含有陽細胞的高倍視野（400×）分別計數100個腫瘤細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。＜5%為0分，5%~25%為1分，26% ~50%為2分，＞50%為3分。染色強度無著色、淺黃、深黃、棕黃分別記為0、1、2、3分。陽細胞比例得分和染色強度得分相加，結果＞3為陽性，≤3為陰性。

1.2.2 細胞培養 人胃癌細胞系MKN74、MKN45在含10%FBS的完全培養基中培養，放入37℃、5%CO2孵化箱中孵育，待細胞融合約90%時，胰酶消化傳代以保持細胞活力。

1.2.3 慢病毒包裝 PReceiverLv/COX-2慢病毒表達載體的構建由GeneCopoeia公司協助完成，使用Stable-3感受態細胞擴增質粒，對COX-2表達質粒、包裝質粒分別進行高純度無內毒素質粒抽提，并通過紫外分光光度儀檢測質粒濃度，轉染293T細胞，48 h后收獲上清液，1 000 r/min離心10 min，并用0.45 μm濾器過濾，收獲病毒液。

1.2.4 細胞感染和穩轉細胞篩選 將細胞以1×105個的密度接種于6孔板中，待細胞達到70%～80%融合時，換為1 mL含5%滅活血清無雙抗的DMEM培養基，并加入1 mL病毒液，37℃，5%CO2培養過夜。吸除含病毒液的培養基，加入完全培養基，并根據預實驗測定的最佳濃度進行puromycin篩選，MKN74最佳篩選濃度為0.4 μg/mL，MKN45最佳濃度為0.6 μg/mL，每3 d換液，并每日熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。

1.2.5 細胞形態檢測 在細胞培養狀態下，將穩轉后的細胞與對照組在倒置顯微鏡下觀察，比較兩者形態變化。

1.2.6 Western blot法檢測 用細胞裂解液RIPASDS裂解細胞，提取其總蛋白，使用12%聚丙烯酰胺凝膠80 V電泳2 h,250 mA恒流壓1.5 h，將目的蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗，4℃孵育過夜，次日室溫恢復1 h，TBST洗膜3次，用相應二抗室溫孵育2h。TBST洗膜3次，加入發光液，顯影，拍照。

1.2.7 PCR檢測 按照Trizol提取試劑盒，對每組細胞分別提取總RNA，經分光光度計定量后，按照cDNA試劑盒說明反轉錄為cDNA并進行PCR反應。將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描結果，用Photoshop軟件進行條帶灰度分析，分別計算與內參的灰度值比。人COX-2的引物序列為F:5′-CTATGGGCAGAGAGAAGGAG-3′，R:5′-AGCTTGCA TGACCAGAACCC-3′；人E-cadherin的引物序列為F:5′-GTCACTGACACCAACGATAATCCT-3′，R:5′-GT CACTGACACCAACGATAATCCT-3′；Vimentin的引物序列為F:5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′，R:5′-G GTCATCGTGATGCTGAGAA-3′；Snail的引物序列為F:5′-TTCTTCGCTACTGCTGCG-3′，R:5′-GGGCAG GTATGGAGA GGAAGA-3′；內參GAPDH的引物序列為F:5′-CCTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3′，R:5′-T GTCATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。

1.2.8 細胞劃痕實驗 以適當的密度將細胞接種于6孔板，用100 μL移液槍頭對細胞表面劃一條痕跡，拍照，繼續培養24 h和48 h后，在顯微鏡下觀察胃癌細胞的遷移變化情況并拍照測量劃痕距離，計算遷移率。

1.2.9 細胞侵襲實驗 每個Transwell小室上表面加入稀釋過的Matrigel（Mstrigel與DMEM體積比1∶3）35 μL，并在培養箱中過夜，次日消化細胞，上室內接種無血清培養的細胞，下室使用常規培養基，48 h后取出小室，用預冷的甲醇固定細胞，結晶紫染色，棉簽拭去上室內細胞，倒置顯微鏡下隨機計數5個視野中細胞的數目，計算平均值。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料采用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗，生存率采用Kaplan-Meier法計算、Log rank檢驗，相關檢驗采用Spearman相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COX-2、Snail的表達與胃癌臨床病理資料特征的關系 COX-2的陽性染色表現為癌細胞胞漿內棕黃色顆粒，而癌組織間質呈現陰性。100例胃癌標本中有60例為陽性表達（60%），胃癌組織中COX-2的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤組織學類型無關，差異無統計學意義（P＞0.05）。COX-2在有淋巴結轉移的胃癌中的陽性率為68.18%，而在無淋巴結轉移的胃癌組織中陽性表達率為44.12%，差異有統計學意義（P＜0.05）；COX-2在有遠處轉移的組織中陽性率為75.00%，而在無遠處轉移的胃癌組織中陽性率為51.56%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。生存分析結果顯示，COX-2陽性組較COX-2陰性組的生存時間短，差異亦具有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。Snail的陽性染色主要定位于細胞核，100例胃癌組織中有 70例為陽性表達（70%），其表達與患者年齡、性別、腫瘤的大小、組織學類型不相關，差異無統計學意義（P＞0.05），與腫瘤的分期、淋巴結轉移和遠處轉移均具有統計學意義（P＜0.05）。Spearman相關分析顯示，COX-2的表達與Snail之間存在相關性（表1、2）。

圖1 COX-2（+）患者與COX-2(-)患者生存時間比較Fig 1 Comparison of survival time in patients of COX-2（+）and patients of COX-2(-)

表1 COX-2、Snail與胃癌臨床病理資料的關系Tab 1 Correlation between the expression of COX-2，Snail and clinicopathology in patients with gastric cancer

表2 COX-2、Snail的相關性分析Tab 2 Spearman analysis of the COX-2 and Snail

2.2 MKN74/control和MKN74/COX-2、MKN45/control和MKN45/shCOX-2細胞形態的改變 MKN74細胞轉染COX-2慢病毒載體后，與對照組比較，細胞形態發生明顯的變化，倒置相差顯微鏡觀察顯示，MKN74/control的細胞呈現典型上皮細胞形態，細胞排列緊密，而MKN74/COX-2的細胞連接更加疏松，細胞拉長，呈現間質細胞樣形態。MKN45/shCOX-2細胞由原來的短梭形轉變為鋪路石樣形態（圖2）。

2.3 MKN74細胞和MKN45細胞轉染前后COX-2、Snail、E-cadherin、Vimentin蛋白、mRNA的表達變化 利用Western blot、PCR檢測MKN74/control和MKN74/COX-2細胞COX-2、Snail、E-cadherin、Vimentin蛋白、mRNA的表達變化情況發現，MKN74/COX-2細胞相比較MKN74/control細胞而言，COX-2表達上調，Snial表達上調，上皮性標志物E-cadherin表達下調，而間質性標志物Vimentin表達上調。在MKN45細胞中，轉染shCOX-2后，Snail、Vimentin蛋白及mRNA表達下調，COX-2、E-cadherin表達上調（圖3）。

圖2 MKN74/control、MKN74/COX-2及MKN45/control、MKN45/shCOX-2細胞形態學改變(×200)Fig 2 The cells morphology showed significant changes among MKN74/control cells and MKN74/COX-2 cells，MKN45/ control cells and MKN45/shCOX-2 cells(×200)

圖3 MKN74細胞、MKN45細胞中COX-2、EMT相關蛋白、mRNA（E-cadherin、Vimentin以及Snail）的表達變化Fig 3 The changes in the expression of COX-2 and EMT-related protein，mRNA(E-cadherin，VimentinandSnail)expressionin MKN74 cells and MKN45 cells were detected by Western blot andPCR

2.4 轉染前后細胞遷移能力的比較 采用劃痕實驗評價COX-2過表達后對MKN74、MKN45細胞遷移能力的影響，實驗表明，與對照細胞相比，MKN74/ COX-2細胞的遷移率顯著高于MKN74細胞，遷移能力顯著增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）。MKN45/shCOX-2細胞的遷移率低于轉染對照組細胞，差異亦具有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 劃痕實驗定量分析比較MKN74/control與MKN74/COX-2細胞，MKN45/control與MKN45/shCOX-2細胞遷移能力變化Fig 4 The changes of migaration ability in MKN74/control and MKN74/COX-2 cells，MKN45/control and MKN45/shCOX-2cells were detected by wound healing assay

2.5 轉染前后細胞侵襲能力的比較 經視野計數統計顯示，MKN74/COX-2細胞穿過Matrigel膠和濾膜的細胞數量明顯多于MKN74/control細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05），MKN74/COX-2細胞的侵襲能力明顯強于MKN74/control細胞。MKN45/ shCOX-2細胞穿過Matrigel膠和濾膜的細胞數量明顯少于MKN45/control細胞，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 比較MKN74/control與MKN74/COX-2細胞，MKN45/control與MKN45/shCOX-2細胞侵襲能力的變化Fig 5 ThechangesofinvasionabilityinMKN74/controlandMKN74/ COX-2 cells，MKN45/control and MKN45/shCOX-2 cells were detected by Transwell assay

3 討論

據2010年統計，中國約有404 565名胃癌患者，男性287 844例，女性116 721例，287 851例死亡，發病率居腫瘤發病率第3位，死亡率排第3位[5]。由此可見，胃癌仍是威脅人類健康的惡性疾病之一，胃癌的高發病率、高死亡率給個人和社會造成了沉重的經濟負擔。

COX-2是一種炎性介質，COX-2在胃癌組織中高表達，并成為判斷胃癌預后的獨立因素[6]。有研究表明，長期且規律的服用阿司匹林或非甾體類抗炎藥可以減低胃癌的發生率、轉移率和死亡率[7-8]。長期服用COX-2抑制劑雖然增加了患心腦血管疾病的危險，在萎縮性胃炎、腸上皮化生和胃癌癌前病變中，其心腦血管疾病的發生率卻并沒有上升[9]。因此，COX-2抑制劑在預防、治療胃癌的應用中被寄予很高的期望。本研究結果表明，胃癌組織中COX-2蛋白表達與淋巴結轉移及遠處轉移有關，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。在Snail的免疫組化實驗中，其表達與淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期有關，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。Spearman相關分析顯示，COX-2蛋白的表達與Snail蛋白的表達呈現正相關關系。熊正文等[10]在乳腺癌的研究中發現Snail mRNA及COX-2 mRNA表達均與乳腺浸潤性導管癌淋巴結轉移有關，乳腺浸潤性導管癌組織中Snail mRNA及COX-2 mRNA表達呈顯著正相關。以上結果提示，COX-2與Snail之間可能存在某種關系。

上皮間質轉換是惡性腫瘤發生發展的中心環節，它指上皮細胞向間質細胞表型轉變，促使靜止的上皮細胞失去極性，細胞-細胞及細胞-間質之間的黏附性發生改變，細胞內的肌動蛋白重新排列，使細胞獲得更強遷移和侵襲能力[11]。其最主要的標志是上皮標志E-cadherin表達的降低。E-cadherin屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，對維持細胞形態、運動及粘附有重要作用[12]。Vimentin是中間絲蛋白家族的主要成員，幾乎表達于所有正常的間質細胞，在維持細胞完整性和抵御外界應急的損傷起了重要的作用[13]。Vimentin已經成為發生EMT的重要標志。在本實驗中，上調COX-2表達后，MKN74細胞變為短梭形，E-cadherin表達顯著降低，而Vimentin表達升高。細胞發生EMT，細胞間黏附連接和緊密連接破壞，最主要的標志是上皮標志E-cadherin表達的減少或丟失，并且細胞形態發生變化。因此，我們認為轉染COX-2后的MKN74細胞發生了EMT。在惡性腫瘤中，E-cadherin介導的細胞間粘附功能減弱或丟失，使惡性腫瘤細胞更容易脫離原發灶向周圍組織侵襲并向遠處器官轉移，這是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的第一步。在劃痕實驗及侵襲實驗中也證明了MKN74/COX-2細胞遷移運動和侵襲能力增強，更進一步說明上調COX-2的表達能增強胃癌細胞遷移和侵襲能力。而MKN45細胞下調COX-2表達后，E-cadherin表達增多，Vimentin表達減少，細胞由原來的短梭形轉變為鋪路石樣結構。說明下調COX-2后的MKN45細胞間的黏附能力增強。劃痕及侵襲實驗結果也表明MKN45/shCOX-2細胞遷移運動及侵襲能力減弱。以上結果說明，COX-2表達增高能抑制E-cadherin的表達，促進EMT的發生，COX-2表達降低能促進E-cadherin的表達，從而抑制胃癌細胞EMT的發生。

EMT相關因子主要指影響表征蛋白表達的轉錄因子，主要包括鋅指蛋白家族的Snail、Slug、ZEB1、E12/E47以及SIP1。本實驗前部分的免疫組化實驗也初步證實了COX-2、Snail與胃癌的侵襲、轉移相關，并且COX-2與Snail之間存在一定的關聯性，為了進一步說明COX-2誘導胃癌EMT的相關機制，筆者檢測了Snail蛋白的表達量。Snail是一種鋅指蛋白結合因子，主要通過識別并結合E-cadherin基因啟動子序列中的E-box元件，直接抑制E-cadherin的轉錄，導致E-cadherin分泌降低，從而影響了上皮間的粘連，促成EMT的發生[14]。在MKN74細胞中，上調COX-2表達后，Snail的表達也隨之上調，而在MKN45/shCOX-2細胞中，Snail的表達下降，在PCR實驗中我們也發現了相同的結果。這說明COX-2的表達促進了Snail的生成，COX-2可以通過Snail通路誘導胃癌EMT的發生。Dohadwala等[15]在非小細胞肺癌（NSCLC）的研究中發現，在非小細胞肺癌細胞系中阻斷COX-2表達后，Snail的表達降低，激活COX-2表達后，Snail的表達升高。應用PGE2對非小細胞肺癌細胞系進行干預，Snail的表達隨著PGE2劑量的增大而增高，兩者具有明顯相關性。結果提示COX-2可能通過前列腺素（PGE2）直接上調Snail的表達，從而調控E-cadherin的表達。COX-2是否還通過其它機制影響Snail仍不清楚，需要進一步的研究。

本實驗的研究表明，COX-2與胃癌的遠處轉移和淋巴結轉移有密切關系，并且預示著較差的預后。在人結腸癌[16]、肝癌[17]、乳腺癌[18]中，COX-2參與了EMT的發生，進而促進腫瘤細胞的遷移侵襲能力。COX-2可以通過Snai/E-cadherin途徑誘導EMT的發生，進一步促進胃癌細胞的遷移和侵襲，這可能為胃癌的診斷、治療和COX-2抑制劑應用于胃癌的預防與治療提供新的思路和啟示。

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（2016-01-25收稿）

Cyclooxygenase-2 promotes gastric cancer invasion and metastasis by inducing epithelial to mesenchymal transition

LI Jing1,SUN Bao-cun1,2,SUN Ran3,ZHAO Xiu-lan1,2,DONG Xue-yi1,2,ZHAO Nan1,2,GU Qiang1,2,ZHANG Dan-fang1,2,LIU Tie-ju1,2
（1.Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Department of Pathology,General Hospital,Tianjin Medical University Tianjin 300052,China;3.Department of Surgery,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin 300100,China)

Objective：To determine the expressions of Cyclooxygenase-2(COX-2)and Snail in gastric cancer,investigate the effect of COX-2 transduction on invasion and migration of gastric cancer cell lines of MKN74 and MKN45,and explore its related mechanism.Methods：The expressions of COX-2 and Snail were examined by immunohistochemical technique.Lentiviruses carrying COX-2 gene were constructed and transducted into MKN74 and MKN45.The changes in morphology,migration,invasion and protein were detected.Results：The expression of COX-2 was positively correlated with metastasis in lymph node and metastasis in distance（P＜0.05).Snail expression was related to stage,lymph node metastasis and distant metastasis in human gastric cancer（P＜0.05）.There was a positive correlation between COX-2 and Snail expressions（P＜0.01）.The MKN74/COX-2 cells showed EMT changes.The migration and invasion abilities were significantly enhanced.Knockdown of COX-2 resulted in inhibited EMT in MKN45 cells.Migration and invasion abilities were significantly receded in MKN45/shCOX-2 cells.Conclusion：COX-2 plays an important role in the origin and development of gastric cancer,COX-2 through EMT promotes the migration and invasion abilities in gastric cancer cells.

gastric cancer;COX-2;epithelial to mesenchymal transition;migration;invasion

R735.2

A

1006-8147（2016）03-0185-06

國家自然科學基金重點項目基金資助（81230050）；國家自然科學基金面上項目基金資助（81572872）

李靜（1986-），女，碩士在讀，研究方向：腫瘤血管生成；通信作者：孫保存，E-mail：Sunbaocun@aliyun.com。