紅景天注射液HPLC指紋圖譜研究

楊勝巖，趙國華，王仁久，房宗寶，吳海波，劉倩，唐鋮，3，段宏泉，3

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.通化玉圣藥業有限公司，通化134000；3.天津醫科大學基礎醫學研究中心，天津300070）

論著

紅景天注射液HPLC指紋圖譜研究

楊勝巖1，趙國華2，王仁久2，房宗寶2，吳海波2，劉倩1，唐鋮1，3，段宏泉1，3

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.通化玉圣藥業有限公司，通化134000；3.天津醫科大學基礎醫學研究中心，天津300070）

目的：建立紅景天注射液的色譜指紋圖譜，為紅景天注射液的質量控制提供依據。方法：采用高效液相色譜法進行檢測，以Agilent XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱為固定相，乙腈-水（0.07%磷酸）為流動相進行梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，檢測波長278 nm，柱溫30℃；以中國藥典指紋圖譜相似度評價系統（2004版）對注射液進行指紋圖譜數據分析。結果：所建立的色譜條件能夠有效分離紅景天注射液的主要成分，確定了6個共有峰，以化學對照品比對結合HPLC-MS鑒定了其中5個色譜峰，分別為沒食子酸、對羥基苯甲酸、酪醇、紅景天苷和對香豆酸。方法學考察結果表明，文中所建分析方法精密度RSD≤1.90%、重現性RSD≤0.32%、穩定性RSD≤1.63%，均符合要求。對9個批次注射液進行的指紋圖譜分析結果表明相似度均大于0.96。結論：文中所建立的指紋圖譜分析方法準確可靠，可以用于紅景天注射液的質量控制。

紅景天注射液；高效液相色譜指紋圖譜；色譜峰鑒定；相似度評價

紅景天（Rhodiola rosea L.）的主要成分為紅景天苷、酪醇和酚酸類化合物等，具有抗疲勞、抗衰老、增強學習記憶、抑制腫瘤、提高免疫等多種功能[1-2]；其所含多元酚類化合物和黃酮類化合物具有抗氧化作用[3]，對心腦血管系統具有保護作用[4-5]；能擴張血管，增加冠脈血流量，減少心肌耗氧量，改善心肌微循環，從而改善心肌的供血供氧[6]，并能夠增強機體對缺氧的耐受力，快速緩解心血管疾病癥狀。近些年來，已有將該藥制成注射液應用于臨床的報道[7]。中藥注射液由于直接進入體內循環系統，其質量控制水平的提高對于保障質量，防止注射液不良反應的發生尤為重要。近年來，指紋圖譜技術被逐步應用于中藥注射液的質量控制，其優點在于可全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例，在大多數中藥有效成分尚未闡明的現狀下，仍可有效地表征中藥質量。與現行的單一有效成分或指標性成分鑒定相比，指紋圖譜所含的信息量更大，更為科學、合理[8]。本文采用高效液相色譜法建立紅景天注射液指紋圖譜分析條件，通過對多批次注射液分析確定共有峰，結合HPLC-MS和HPLC保留時間和對照品疊加試驗方法對共有峰進行指認，進一步通過方法學考察建立色譜指紋圖譜分析方法，為該產品的質量控制方法的改進提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200 series高效液相色譜儀，包括二元高壓泵、柱溫箱、自動進樣器、紫外-可見光檢測器，Agilent Chemstation工作站；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004版（國家藥典委員會）；分析天平（十萬分之一，上海恒平科學儀器有限公司）。

紅景天苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110818-201206）；酪醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111676-200602）；乙腈（色譜純，百靈威公司）；超純水（Merck Millipore Q-Gard T1）；其他試劑均為市售分析純；紅景天注射液(通化玉圣藥業有限公司，批號：3001141104-1，3001141105-1，3001141201-1，3001141202-1，3001141204-1，3001141205-1，3001141206-1，3001141207-1，3001150105-1，3001150106-1，3001150107-1，3001150108-1，3001150109-1，3001150110-1，3001150201-1，3001150202-1，3001150203-1，3001150204-1，3001141103-1，3001141208-1，3001141209-1，3001141210-1，3001150101-1，3001150102-1，3001150103-1，1001150401-1，1001150402-1）。

1.2 方法

1.2.1 對照品及供試品溶液的配制 精密稱取紅景天苷對照品5.12 mg，酪醇對照品1.72 mg，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制得濃度為0.512mg·mL-1的紅景天苷貯備液和0.172 mg·mL-1的酪醇貯備液。精密吸取紅景天注射液1.0 mL，用超純水稀釋至10.0 mL，搖勻，所得溶液經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 色譜條件 本品含有的主要藥效物質為紅景天苷和酪醇等苯乙醇苷化合物，通過紅景天苷、酪醇全波長掃描分析可知，上述化合物的最大吸收波長均在278 nm。故本文選擇278 nm作為檢測波長。固定相：Agilent XDB C18色譜柱（5 μm，250 mm× 4.6 mm）；流動相：A-乙腈，B-0.07%磷酸水溶液，梯度洗脫，0～10 min，0～0A；10～30 min，0～3%A；30～38min，3%～5%A；38～45min，5%～7%A；45～50min，7%～13%A；50～60min，13%～22%A；檢測波長：278nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min-1。

1.2.3 色譜指紋圖譜的建立

1.2.3.1 共有峰的確定：按照“1.2.2”項下色譜條件，分析18批注射液的色譜指紋圖譜。

1.2.3.2 各色譜峰的化學成分鑒定：參照文獻[9]并適當調整，建立質譜分析條件如下：（1）儀器一：Agilent 1200 series高效液相色譜儀，Bruker HCT Iontrap三維離子阱質譜儀，BrukerESICompass1.3for HCT/Esquire工作站；質譜條件：ESI源，負離子檢測模式，掃描范圍為m/z100～1000，毛細管電壓為145 V，錐孔電壓為30 V，脫溶劑氣為氮氣，350℃，8 L/min。（2）儀器二：Agilent 6520 QTOF四極桿-飛行時間串聯質譜儀，Agilent MassHunter Workstation Qualitative Analysis工作站；質譜條件：ESI源，負離子檢測模式，掃描范圍為m/z 50～1 000，毛細管電壓為200 V，錐孔電壓為30V，脫溶劑氣為氮氣，180℃，6L/min。

1.2.4 色譜指紋圖譜方法學考察

1.2.4.1 精密度試驗：取同一批次紅景天注射液1支，按“1.2.1項”下制備方法制備供試液；按“1.2.2項”下色譜條件，連續進樣6次。

1.2.4.2 重現性試驗：取同一批次紅景天注射液6支，分別按“1.2.1項”下制備方法制備供試液6份；按“1.2.2項”下色譜條件，分別進樣分析。

1.2.4.3 穩定性試驗：取同一批次紅景天注射液1支，按“1.2.1項”下制備方法制備供試液；按“1.2.2項”下色譜條件，分別于0、2、6、10、12、24 h進樣分析。

1.2.5 對照圖譜的生成和相似度評價 對18批紅景天注射液按“1.2.2項”下色譜條件進行測定。將紅景天注射液色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》研究，計算各樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度。

1.2.6 市售樣品指紋圖譜的相似度評價 取市售該企業的9批注射液，按上文中建立的指紋圖譜測定方法檢測，將所得指紋圖譜和上述紅景天注射液對照指紋圖譜通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004B版》對各圖譜進行全譜匹配，計算各樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度。

2 結果

2.1 色譜指紋圖譜的建立

2.1.1 共有峰的確定 通過比較18批供試品色譜指紋圖譜的共有色譜峰，選擇穩定性好、吸收強、特征明顯的色譜峰為共有峰，共標定6個峰，見圖1。

圖1 紅景天注射液的色譜指紋圖譜Fig 1 The chromatographic fingerprint of Hongjingtian injection

2.1.2 各色譜峰的化學成分鑒定 通過分子離子峰與紅景天化學成分比較分析，分子離子峰提取TIC峰與UV色譜峰保留時間比對，鑒定了5個化學成分，見表1。

表1 5個共有色譜峰的化學成分鑒定Tab 1 Identifyingchemicalconstituentsof5commonchromatographic peaks

進一步采用化學對照品的保留時間及與注射液疊加試驗分析對比，最終確定本文鑒定的5個共有色譜峰的化學成分無誤。

2.2 色譜指紋圖譜方法學考察

2.2.1 精密度試驗結果 對共有峰進行比較，選定第5個共有峰紅景天苷為參照物峰（S峰），結果顯示各共有峰相對保留時間RSD≤0.16%，各共有峰相對峰面積RSD≤1.90%，表明精密度良好。

2.2.2 重現性試驗結果 各共有峰相對保留時間RSD≤0.17%，各共有峰相對峰面積的RSD≤0.32%，表明所建方法重現性較好。

2.2.3 穩定性試驗結果 各共有峰相對保留時間RSD≤0.83%，各共有峰相對峰面積RSD≤1.63%。表明所建方法穩定性良好。

2.3 對照圖譜的生成和相似度評價 對18批紅景天注射液進行測定并將紅景天注射液色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》，研究結果見圖2，相似度計算結果顯示18批樣品相似度均在0.9以上，平均為0.982，RSD為0.85%。生成紅景天注射液對照指紋圖譜見圖3。

2.4 市售樣品指紋圖譜的相似度評價 各樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度結果見表2，9批注射液相似度均高于0.970，表明不同批次紅景天注射液相似度較高，指紋圖譜相似性良好說明工藝較穩定。

圖2 1～18批紅景天注射液指紋圖譜（R為對照指紋圖譜）Fig 2 The fingerprints of the 1-18 batches of Hongjingtian injection(R is the control fingerprint)

圖3 紅景天注射液對照指紋圖譜Fig 3 Control fingerprint of the Hongjingtian injection

表2 9批紅景天注射液樣品相似度評價結果Tab 2 Results for the similarity evaluation of the 9 batches of Hongjingtian injection

3 討論

在檢測波長選擇方面：由于中藥產品中存在的物質成分差別較大，指紋圖譜樣品在色譜響應行為上也有較大差別。因此檢測波長的選擇就顯得尤為重要[10]。檢測波長選擇的主要原則是整體全面，盡可能減少數據間差別，達到最優化的顯示[11]。本品主要化學成分為紅景天苷和酪醇，兩者最大吸收均為278 nm，結合DAD檢測譜圖中紅景天各色譜峰隨波長的峰高分布情況，研究表明該化合物在278 nm波長處色譜峰數目最多且峰面積最大，可滿足有效指紋信息最大化原則，故最終確定以278 nm檢測波長用于注射液的綜合質量控制。

在色譜柱選擇方面：本文分別采用Agilent XDB C18（250mm×4.6mm，5μm）、AgilentXDBC18（150mm× 4.6mm，5μm）、AgilentZorbaxSBC18（250mm×4.6mm，5 μm）和Agilent Zorbax Extend C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）4種色譜柱，對同一批號的樣品進行分析比較。結果顯示紅景天苷和酪醇在使用Agilent XDB C18分離時，可將各組分較好地分離，峰形良好并且分析時間較短，故最終選用Agilent XDB C18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)進行指紋圖譜檢測。

在特征峰的指認方面，本文進一步做了HPLC疊加分析試驗。眾所周知，HPLC-MS聯用技術雖然能夠快速鑒定色譜指紋圖中色譜峰所對應的化學成分結構，但是無法準確區別分子量相同而化學結構不同的化學成分，特別是中藥化學成分組成復雜，同分異構體也很多，很難利用分子離子峰的裂解規律進行鑒定。現有文獻報道常采用混合化學對照品分析，通過保留時間指認色譜峰所對應化學成分，但由于儀器分析精密度的局限性，如無法區分保留時間相差0.1～0.2 min的不同化學成分，而疊加試驗則可以避免這類問題。本研究采用化學對照品與注射液疊加試驗作為色譜峰鑒定的補充。上述兩種方法相結合，鑒定的指紋圖譜中色譜峰所對應化學成分準確、依據充分。

本文建立的HPLC測定紅景天注射液指紋圖譜的方法，能較為全面地反映紅景天注射液的化學組成及其相對比例，有助于對藥品質量進行整體描述和評價。

[1]國家藥典委員會.中國藥典 (一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:154-154

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（2015-09-15收稿）

Study on fingerprint of Hongjingtian injection by HPLC

YANG Sheng-yan1,ZHAO Guo-hua2,WANG Ren-jiu2,FANG Zong-bao2,WU Hai-bo2,LIU Qian1,TANG Cheng1,3,DUAN Hong-quan1,3
（1.Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics),School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Tonghua Yu Sheng Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tonghua 134000,China; 3.Research Center of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)

Objective：To establish a HPLC fingerprint method and improve the quality control of Hongjingtian injection.Methods：Agilent XDB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used as stationary phase.And water containing 0.07%phosphoric acid－acetonitrile system was utilized as a mobile phase,at the flow rate of 0.8 mL·min-1.The detection wavelength was 278 nm,and the column temperature was set at 30℃.All the data was analyzed by fingerprint evaluation system(2004).Results：Components of Hongjingtian injection were analyzed.Six common peaks were obtained for standard fingerprint chromatography and five of them such as gallic acid,p-hydroxybenzoic acid,tyrosol,salidroside,p-hydroxycinnamic acid were identified by HPLC-MS and standard compounds.The similarities of nine batches sample were above 0.96.Conclusion：HPLC fingerprint method is accurate and reliable,and could be used for the quality control of Hongjingtian injection.

Hongjingtian injection;HPLC fingerprint;chromatograpic peak identification;similarity evaluation

R9

A

1006－8147（2016）02-0164-04

楊勝巖(1991-),女,碩士在讀,研究方向：中藥現代質量控制與質量標準；通信作者：段宏泉,E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。