豆清發(fā)酵液中一株產(chǎn)細菌素乳酸球菌的分離鑒定

孫　菁，張臣飛，尹樂斌，2，孔小婷，周新星，夏秋良，趙良忠

（1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽　422000；2.豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地建設(shè)，湖南邵陽　422000）

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豆清發(fā)酵液中一株產(chǎn)細菌素乳酸球菌的分離鑒定

孫菁1，張臣飛1，*尹樂斌1，2，孔小婷1，周新星1，夏秋良1，趙良忠1

（1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽422000；2.豆制品加工技術(shù)湖南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基地建設(shè)，湖南邵陽422000）

摘要：從豆制品生產(chǎn)副產(chǎn)物豆清發(fā)酵液中分離得到1株產(chǎn)細菌素球狀菌，編號SQ- 12- 3。結(jié)合菌株生長特征、菌體形態(tài)及生理生化性質(zhì)，初步將其鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。排除發(fā)酵液中可能存在的有機酸、過氧化氫及菌株菌體的干擾，并檢測抑菌物質(zhì)蛋白酶穩(wěn)定性，可確定菌株SQ- 12- 3產(chǎn)細菌素抑菌。研究該菌株產(chǎn)細菌素動態(tài)，確定菌株最適生長溫度在37℃，菌株在該溫度下發(fā)酵18 h后菌液pH值低至4.11；當NaCl質(zhì)量分數(shù)大于7％時，菌株生長受到明顯抑制。

關(guān)鍵詞：乳酸球菌；細菌素；豆清發(fā)酵液

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌通稱，在自然界中分布廣泛，并在利用乳糖等發(fā)酵糖[1]的代謝過程中產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、細菌素和二乙酰等具有抑制腐敗菌生長的物質(zhì)，是健康人和動物腸道的優(yōu)勢菌群之一，對于維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)定與健康發(fā)揮著重要的作用[2-4]。細菌素是細菌代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對同種或親緣關(guān)系較近的、有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)，而具有廣譜抑菌作用的細菌素很少見。乳酸菌可產(chǎn)細菌素，乳酸菌細菌素是一種殺菌蛋白或多肽,可抑制廣譜的革蘭氏陽性菌，尤其是抑制一些腐敗菌和病原菌且與鰲合劑結(jié)合，可以將其活性譜拓寬到革蘭氏陰性菌，因而為食品加工和食品保藏提供了一個新方法[5-6]。

豆清發(fā)酵液是豆腐生產(chǎn)過程中廢液經(jīng)自然發(fā)酵而形成，俗稱黃漿水、酸水，是一種傳統(tǒng)的天然豆腐凝固劑[5]。以豆清發(fā)酵液點漿的豆腐，不僅質(zhì)地細膩、持水性好，而且乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸及蛋白酶等物質(zhì)還增加了豆腐獨特風味，并保持了良好的組織狀態(tài)，深受廣大消費者歡迎。目前，有關(guān)豆清發(fā)酵液的研究主要集中在其循環(huán)再利用及其產(chǎn)酸發(fā)酵條件優(yōu)化[7-10]，有關(guān)利用豆清蛋白發(fā)酵產(chǎn)乳酸菌細菌素相關(guān)研究還未見報道。本文從湖南省傳統(tǒng)豆制品企業(yè)的豆清發(fā)酵液中分離篩選產(chǎn)細菌素的乳酸菌，并對其進行初步鑒定及相關(guān)生物學特性研究，旨在為其進一步開發(fā)提供理論依據(jù)，并為充分利用這些優(yōu)良菌種奠定了基礎(chǔ)，也對充分挖掘豆清發(fā)酵液的乳酸菌資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

豆清發(fā)酵液（pH值為3.45），采集于湖南省恭兵食品有限公司豆制品生產(chǎn)車間，保存于4℃冰箱備用。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）均保存于邵陽學院生物與化學工程系。

乳酸菌分離及發(fā)酵培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，吐溫- 80 0.1 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至6.0）；指示菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值調(diào)至7.2）；胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、蛋白酶K，購自成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司。

SW- CJ- 1D型單人單面潔凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋，寧波久興醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；BA301 Digital型電子顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)有限公司產(chǎn)品；VELOCITY18R型高速冷凍離心機，馭锘實業(yè)有限公司產(chǎn)品；IS- RDD3型全溫搖床，美國精騏有限公司產(chǎn)品；EL20型pH計，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的分離純化

豆清發(fā)酵液樣品（pH值3.45）粗過濾后，先于37℃下以轉(zhuǎn)速50 r/min搖床培養(yǎng)1 h，然后取搖床培養(yǎng)后樣品用滅菌的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，并在超凈工作臺內(nèi)分別取1 mL各梯度稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿，再于皿內(nèi)進行MRS培養(yǎng)基倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，于37℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。培養(yǎng)期間觀察是否有明顯溶鈣圈，并挑取特征菌落分離純化，多次革蘭氏鏡檢后與《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版[11]進行對比，符合乳酸菌形態(tài)特征的菌株制備發(fā)酵液，打孔法[12]測定對指示菌的抑菌活性。

1.2.2菌株產(chǎn)細菌素的確認

除細菌素外，乳酸菌在生長過程中代謝還可以產(chǎn)生其他具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機酸、過氧化氫、雙乙酰等[12-13]。因此，在篩選產(chǎn)細菌素的乳酸菌菌株時必須排除這些干擾因素，確定抑菌作用是由細菌素所引起。

（1）有機酸抑菌作用的排除。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫靜置發(fā)酵2 d，離心收集豆清發(fā)酵上清液，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至6.0。以同pH值乳酸和乙酸為對照，檢測抑菌活性。

（2）過氧化氫抑菌作用的排除。按1∶1體積比例，0.5 mg/mL H2O2酶液加至pH值7.0菌株發(fā)酵上清液，于37℃下恒溫水浴2 h。以原菌株發(fā)酵上清液為對照，于37℃下培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈大小。重復3次，求平均值。

（3）細菌過濾器除去菌體的干擾。發(fā)酵上清液經(jīng)細菌過濾器分離雜質(zhì)[14]，收集濾液重復進行抑菌試驗，觀察2次抑菌試驗中抑菌圈大小是否有顯著差別。

（4）抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性。在排除有機酸、過氧化氫和菌株菌體干擾后，在發(fā)酵上清液中分別加入2 mg/mL胰蛋白酶、胃蛋白酶及蛋白酶K 5 mL，隨后分別調(diào)節(jié)pH值至3種最適生長值。于37℃下滅酶2 h后，將pH值調(diào)至7.0，檢測抑菌活性。

1.2.3菌株生物學特性研究

（1）菌株生長曲線。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫發(fā)酵1 d，每間隔2 h抽取樣品，搖勻測定發(fā)酵液OD600 nm值，24 h后繪制菌株的生長曲線。

（2）菌株發(fā)酵產(chǎn)酸。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，于37℃下恒溫發(fā)酵1 d，每間隔2 h抽取樣品，搖勻測定發(fā)酵液pH值，24 h后繪制菌株的產(chǎn)酸曲線。

（3）菌株的最適生長溫度。以2％接種量將活化的菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基，分別置于27，32，37，42，47℃恒溫靜置發(fā)酵1 d，搖勻后取樣測定不同溫度發(fā)酵液的OD600 nm值，確定菌株的最適生長溫度。

（4）菌株對鹽的耐受性。以2％接種量將活化的菌株接種至分別含3％，5％，7％，9％，11％ NaCl 的MRS液體培養(yǎng)基，于最適生長溫度下發(fā)酵1 d，搖勻后取樣測定不同NaCl質(zhì)量分數(shù)發(fā)酵液的OD600 nm值，確定菌株對鹽的耐受性。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選

經(jīng)過平板反復劃線，分離得到5株有抑菌圈的乳酸菌，并通過測定這5株菌株對指示菌菌落周圍形成抑菌圈的大小來判斷抑菌效果的好壞，結(jié)果得到1株抑菌效果最好的菌株，編號為SQ- 12- 3。

5株菌株對不同指示菌的抑菌效果見圖1。

2.2菌株SQ- 12- 3的鑒定

2.2.1菌株SQ- 12- 3的形態(tài)學鑒定

菌株SQ- 12- 3在培養(yǎng)基上呈乳白色、不透明的圓形小菌落狀，微微隆起，表面光滑，有光澤，菌落邊緣整齊，有較大的溶鈣圈，無色素，兼性厭氧生長。革蘭氏染色陽性，形態(tài)呈球狀，無芽孢、鞭毛和莢膜，不運動，不形成內(nèi)生芽孢，（0.5～0.7 μm）×（0.5～0.7 μm）。

圖1　5株菌株對不同指示菌的抑菌效果

菌落、菌體形態(tài)及菌株溶圈鈣見圖2。

圖2　菌落、菌體形態(tài)及菌株溶圈鈣

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版、《常見細菌鑒定手冊》[15]及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對菌株SQ- 12- 3進行生理生化試驗。菌株SQ-12- 3的菌落及菌體形態(tài)、生理生化特性符合《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中有關(guān)乳酸菌典型菌落特征的描述，初步鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。

2.2.2菌株SQ- 12- 3的生理生化鑒定

菌株SQ- 12- 3的生理生化特性見表1。

表1　菌株SQ- 12- 3的生理生化特性

由表1可知，在糖發(fā)酵試驗中，可以利用乳糖、麥芽糖、蔗糖，不能利用水楊苷和甘露醇；并在生化試驗中，接觸酶試驗呈陰性、明膠試驗陰性、吲哚試驗呈陰性及H2S試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陽性。綜合以上，可初步判定菌株SQ- 12- 3為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。

2.3菌株SQ- 12- 3產(chǎn)細菌素的鑒定

2.3.1有機酸及過氧化氫作用的排除

乳酸菌的代謝產(chǎn)物（如有機酸、過氧化氫）會有一定的抑菌效果。在鑒定菌株SQ- 12- 3的抑菌作用前，要排除這些干擾因素。

菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液和有機酸的抑菌作用見表2。

表2　菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液和有機酸的抑菌作用

由表2可知，pH值6.0的乳酸和乙酸對指示菌均無抑菌作用，而除單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌圈外，其他指示菌在pH值6.0的發(fā)酵液與原發(fā)酵液的抑菌圈大小差異不明顯，表明在排除有機酸物質(zhì)后，發(fā)酵液中仍存在其他抑菌物質(zhì)；H2O2酶處理菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液后，其抑菌圈比原發(fā)酵液抑菌圈略有減小，但除單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌圈外，差異仍不明顯，由此說明發(fā)酵液中除H2O2外還存在其他抑菌物質(zhì)。

2.3.2菌體干擾的排除

菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無菌體發(fā)酵液的抑菌作用見表3。

表3　菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無菌體發(fā)酵液的抑菌作用

在排除菌體干擾試驗中，通過試驗比較菌株SQ- 12- 3發(fā)酵液與無菌體發(fā)酵液的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除單核細胞增生李斯特氏菌外，發(fā)酵液經(jīng)細菌過濾器處理后抑菌圈與原發(fā)酵液的抑菌圈大小差別基本不明顯，由此說明菌體無抑菌作用。

2.3.3菌株酶穩(wěn)定性的檢測

發(fā)酵液與酶處理發(fā)酵液的抑菌作用見表4。

表4　發(fā)酵液與酶處理發(fā)酵液的抑菌作用

由表4可知，菌株SQ- 12- 3發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后均無抑菌作用。由此表明，發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K均非常敏感。初步判定，該抑菌物質(zhì)是一類具有蛋白質(zhì)特性的細菌素。

2.4菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長特性研究

菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長特性動態(tài)曲線見圖3。

圖3　菌株SQ- 12- 3產(chǎn)酸及生長特性動態(tài)曲線

由圖3可知，菌株SQ- 12- 3生長曲線的延滯期為4 h，該時期活菌數(shù)變化極其微小；4 h后進入對數(shù)生長期，活菌數(shù)呈對數(shù)增加；16 h后進入穩(wěn)定期，該時期活菌數(shù)最大；20 h后進入衰亡期，活菌數(shù)呈下降趨勢。由于延滯期的原因，前4 h內(nèi)菌株pH值變化幅度極小；8 h后菌液pH值曲線急劇下降；菌株發(fā)酵18 h后，菌液pH值低至4.11。

2.5菌株最適生長溫度

菌株SQ- 12- 3最適生長溫度見圖4。

圖4　菌株SQ- 12- 3最適生長溫度

由圖4可知，當溫度較低時，OD600 nm值隨溫度升高，而逐漸升高；當溫度到達37℃時，OD600 nm值達到最大；當溫度超過37℃時，OD600 nm值隨溫度升高而逐漸降低。其原因是乳酸菌的最適生長溫度是35～43℃，溫度超過或低于這個范圍菌株的生長會受到抑制，故溫度太低，菌株SQ- 12- 3的生長速度會很慢；溫度太高，菌株SQ- 12- 3的活性會被抑制或喪失，造成菌體死亡。

2.6菌株SQ- 12- 3對鹽的耐受性

菌株SQ- 12- 3對鹽的耐受性見圖5。

圖5　菌株SQ- 12- 3對鹽的耐受性

由圖5可知，在低鹽濃度下，菌株SQ- 12- 3的OD600 nm值無明顯變化；當NaCl質(zhì)量分數(shù)為7％時，OD600 nm值有下降趨勢；當NaCl質(zhì)量分數(shù)超過7％時，菌株SQ- 12- 3的OD600 nm值隨質(zhì)量分數(shù)增加而降低。原因是鹽度增大，菌體的滲透壓增大，會使細胞喪失活性，抑制了菌株SQ- 12- 3的生長。

3結(jié)論與討論

從湖南省傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)副產(chǎn)物豆清發(fā)酵液中分離出的5株菌株，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌為指示菌，根據(jù)菌斑周圍形成的抑菌圈大小挑選得到1株抑菌效果較好的菌株，編號為SQ- 12- 3。結(jié)合菌株生長特征、菌體形態(tài)及生理生化性質(zhì)，初步將其鑒定為乳球菌屬（Lactococcus sp.）。乳酸菌可通過單一的代謝產(chǎn)物或由有機酸、過氧化氫、二乙酰和細菌素，以及所生產(chǎn)的酶共同起作用[16]。國內(nèi)外科研人員已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌細菌素有40余種[17-20]，但只有Nisin得到公認并應(yīng)用于生產(chǎn)。通過排除有機酸、過氧化氫及菌株菌體的干擾并檢測抑菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性，確定菌株SQ- 12- 3的抑菌活性物質(zhì)為細菌素。通過鑒定菌株SQ- 12- 3的一系列生物學特性，該菌株最適生長溫度在37℃，菌株在該溫度下發(fā)酵18 h后菌液pH值低至4.11；當NaCl質(zhì)量分數(shù)大于7％時，菌株SQ- 12- 3生長受到明顯抑制。本研究為菌株的進一步發(fā)酵提供理論依據(jù)，并對從豆清發(fā)酵液中挖掘乳酸菌資源及循環(huán)再利用豆制品企業(yè)廢水等研究均具有重要意義。

參考文獻：

[1]凌代文，東秀珠.乳酸菌的分類鑒定及實驗基礎(chǔ)[M] .北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：18-21.

[2]Ghanbari M，Jami M，Kneifel W，et al. Antimicrobial activity and partial characterization of bacteriocins produced by Lactobacilli isolated from sturgeon fish [J] . Food Control，2013，32：379-385.

[3]De Souza Barbosa M，Todorov S D，Ivanova I，et al. Improving safety of salami by application of bacteriocins produced by an autochthonous Lactobacillus curvatus isolate [J] . Food Microbiol，2015，46：254-262.

[4]Barbosa M S，Todorov S D，Jurkiewicz C H，et al. Bacteriocin production by Lactobacillus curvatus MBSa2 entrappedin calcium alginate during ripening of salami for control of Listeria monocytogenes [J] . Food Control，2015，47：147-153.

[5]貢漢生，孟祥晨.乳酸菌細菌素分類與作用機制[J] .食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）：105-108.

[6]李平蘭，張篪，江漢湖.乳酸菌細菌素研究進展[J] .微生物學通報，1998，25（5）：295-298.

[7]陳則華，李理.利用大豆黃漿水的發(fā)酵研究[J] .食品研究與開發(fā)，2007，28（3）：42-46.

[8]于海峰，徐國華，盧松，等.酸漿中嗜酸乳桿菌在豆腐廢水發(fā)酵中的條件研究[J] .發(fā)酵科技通訊，2011，40（1）：21-23.

[9]劉平，李曉峰，譚新敏.利用大豆黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12的工藝探索[J] .陜西科技大學學報（自然科學版），2004，21（4）：83-85.

[10]熊衛(wèi)東，衛(wèi)軍.利用豆渣、黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)曲酸的研究[J] .食品研究與開發(fā)，2004，25（4）：52-57.

[11]布坎南R E，吉本斯N E，著.中國科學院微生物研究所，譯.伯杰細菌鑒定手冊[M] .北京：科學出版社，1984：136-141.

[12]騰利志，錢方，姜淑娟，等.產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌的篩選及分類鑒定[J] .食品與機械，2014，29（6）：45-48.

[13]周配東，潘道東，張玉千，等.產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌的篩選及其所產(chǎn)細菌素的特性[J] .食品科學，2011，32（17）：303-307.

[14]劉國榮，周康，李平蘭，等.傳統(tǒng)干酪中一株產(chǎn)Ⅱa類細菌素乳酸菌的分離與鑒定[J] .食品科學，2007，28（5）：185-189.

[15]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M] .北京：科學出版社，2001：242-244.

[16]Pasteris S E，Pingitore E V，Ale C E，et al. Characterization of a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. Lactis CRL 1584 isolated from a Lithobates catesbeianus hatchery [J] . World J Microbiol Biotechnol，2014，30（3）：1 053-1 062.

[17]李悅，孫玉梅，楊紅，等.產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及其發(fā)酵特性[J] .大連工業(yè)大學學報，2008，27（1）：19-21.

[18]Saraiva M A F，Nes I F，Baracat-Pereira M C，et al. Purification and characterization of a bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. Lactis PD6. 9 [J] . Journal of Microbiology and Antimicrobials，2014，6（5）：79-87.

[19]Hwanhlem N，Jaffrès E，Dousset X，et al. Application of a nisin Z-producing Lactococcus lactis subsp. Lactis KT2W2L isolated from brackish water for biopreservation in cooked，peeled and ionized tropical shrimps during storage at 8℃under modified atmosphere packaging [J] . Eur Food Res Technol，2015（15）：2 428-2 436.

[20]陳沛，王雪青，阮海華.產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及其純化和穩(wěn)定性研究[J] .天津師范大學學報（自然科學版），2011，31（2）：82-85.

Isolation and Identification of a Bacteriocin- producing Lactococcus sp. Strain Isolated from Fermented Soybean Processing Wastewater

SUN Jing1，ZHANG Chenfei1，*YIN Lebin1，2，KONG Xiaoting1，ZHOU Xinxing1，XIA Qiuliang1，ZHAO Liangzhong1
（1. Department of Biology and Chemical Engineering，Shaoyang University，Shaoyang，Hu'nan 422000，China；2. Soybean Processing Techniques of the Application and Basic Research Base in Hu'nan Province，Shaoyang，Hu'nan 422000，China）

Abstract：A bacteriocin- producing lactic acid bacteria strain designated as SQ- 12- 3 is isolated from natural fermentation broth of a soybean plant. By excluding the disturbances of organic acids and H2O2to antibacterial activity of indicator bacteria，and after the fermentation broth protein stability analysis，the antibacterial substance is determined as bacteriocin. On the basis of the colonies，cells morphology，dissolved calcium circle，physiological and biochemical characteristics，strain SQ- 12- 3 is preliminary identified as Lactococcus sp. The biological characteristics of strain SQ- 12- 3 show that，its optimum growth temperature is at 37℃，after 16 hours fermentation，the pH value reach 4.11 and it has a wider range of salt tolerance. When the NaCl concentration is greater than 7％，and the growth of this strain is significantly inhibited.

Key words：Lactococcus sp.；bacteriocins；fermented soybean processing wastewater

*通訊作者：尹樂斌（1982—），男，博士，講師，研究方向為食品微生物。

作者簡介：孫菁（1994—），女，本科，研究方向為食品質(zhì)量與安全。

基金項目：湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（2014[445]）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2015B604）。

收稿日期：2016- 01- 19

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0044- 05

中圖分類號：Q935

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.012