QIAGEN實時PCR與COBAS TaqMan檢測血清HBV DNA預測慢性乙型肝炎肝組織病理狀態的性能比較

張占卿　陸偉　王平安　王雁冰　周新蘭　丁榮蓉　李秀芬　黃丹

201508　上海市公共衛生臨床中心肝炎二科(張占卿，陸偉，王雁冰，周新蘭，丁榮蓉，李秀芬，黃丹)；上海新培晶醫學檢驗所(王平安)

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·論著·

QIAGEN實時PCR與COBAS TaqMan檢測血清HBV DNA預測慢性乙型肝炎肝組織病理狀態的性能比較

張占卿陸偉王平安王雁冰周新蘭丁榮蓉李秀芬黃丹

201508上海市公共衛生臨床中心肝炎二科(張占卿，陸偉，王雁冰，周新蘭，丁榮蓉，李秀芬，黃丹)；上海新培晶醫學檢驗所(王平安)

【摘要】目的比較QIAGEN實時PCR與COBAS TaqMan檢測血清HBV DNA水平預測慢性乙型肝炎肝組織病理狀態的性能。方法慢性乙型肝炎患者278例，其中HBeAg陽性和陰性分別為162例和116例。采用QIAGEN實時定量PCR和COBAS TaqMan系統檢測血清HBV DNA。肝組織病理學診斷采用Scheuer評分系統，其中病理學分級和分期包括G0～G4和S0～S4。結果血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在HBeAg陽性患者G2與G3，S1、S2、S3與S4之間的差異有統計學意義(P均<0.05)；在HBeAg陰性患者G1與G2、G3，S1與S2、S3、S4之間的差異有統計學意義(P均<0.05)。血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的不一致率，在HBeAg陽性患者G1-2、G3和S1-3、S4分別為4.24%(5/118)、9.09%(4/44)和3.68%(5/136)、7.69%(2/26)，在HBeAg陰性患者G1、G2-3和S1、S2-4分別為6.02%(5/83)、3.03%(1/33)和3.29%(2/61)、3.64%(2/55)。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陽性患者≥G3、≥S4的ROC曲線下面積分別為0.645和0.695、0.703和0.755，預測HBeAg陰性患者≥G2、≥S2的ROC曲線下面積分別為0.848和0.817、0.756和0.756。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陽性患者≥S4的最佳截斷值分別為≤3.784×106 IU/mL和≤6.668×107 IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.654和1.000、0.735和0.581；預測HBeAg陰性患者≥G2的最佳截斷值分別為≥5.821×103 IU/mL和≥9.311×103 IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.970和0.909、0.614和0.651。結論血清HBV DNA預測肝組織病理狀態的特點為預測HBeAg陰性患者≥G2的效能最大，并且血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陰性患者≥G2的性能有高度一致性。

【關鍵詞】HBV DNA定量；QIAGEN試劑；COBAS TaqMan系統；慢性乙型肝炎；肝組織；病理學

雖然HBV感染宿主的免疫應答模式和機制尚未充分闡明，但血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA和抗-HBc水平在慢性HBV感染史的不同階段存在差異[1-6]。研究發現，血清HBsAg、HBcrAg水平和HBV DNA對慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的肝組織病理狀態有預測意義，但不同研究的結果之間存在差異[7-16]。除研究對象的基線特征、樣本含量和病理學診斷的偏倚外，研究指標的檢測方法和試劑性能也可能是影響其預測效能的一個重要因素。本文采用QIAGEN實時PCR和COBAS TaqMan檢測CHB患者血清HBV DNA，進一步評價血清HBV DNA預測CHB肝組織病理狀態的效能，同時探討兩種方法檢測血清HBV DNA定量預測CHB肝組織病理狀態性能的一致性。

資料和方法

一、研究對象

2012年1月至2014年12月上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心住院的CHB患者278例，其中HBeAg陽性和陰性分別為162例和116例。HBeAg陽性患者中，男109例，女53例，男∶女= 2.1∶1；年齡14～66歲，平均(33.2±9.3)歲；HBeAg陰性患者中，男75例，女41例，男∶女= 1.8∶1；年齡17～63歲，平均(41.8±12.4)歲。診斷符合2010年中華醫學會肝病學分會、感染病學分會聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》中的標準。所有患者均無失代償期肝病的臨床表現和實驗室依據。合并其他病毒性肝炎、藥物性肝病、遺傳性肝病、血吸蟲性肝病以及自身免疫性疾病、內分泌與代謝疾病、血液系統疾病，近6個月內接受干擾素、核苷(酸)、甾體激素類藥物治療的患者被排除。

二、病理學診斷

肝組織活檢采用1秒鐘經皮肝穿刺法，標本采集后立即置塑料標本管內冰凍送檢。肝組織置塑料包埋盒中，進行中性甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟浸入和包埋、切片，蘇木素-伊紅染色和網狀纖維染色。肝組織標本的質量評價和肝組織病理學診斷由1名有經驗的病理學醫師獨立完成。肝組織病理學診斷采用Scheuer評分系統，肝組織病理學分級包括G0～G4五級，分期包括S0～S4五期。

三、血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA檢測

所有患者于肝穿刺前后1周內早晨空腹采集靜脈血，分離血清。血清HBsAg和HBeAg采用Abbott Architect I2000及其配套試劑檢測，正常參考值下限分別為0.05 IU/mL和1.0 S/CO。血清HBV DNA采用兩種方法檢測：①QIAGEN實時定量PCR檢測，試劑購自深圳QIAGEN生物工程有限公司，線性檢測范圍5×102～5×107IU/mL；②Roche全自動COBAS TaqMan系統檢測，線性檢測范圍2×10～1.7×108IU/mL。

四、統計學方法

采用SPSS 16.0和Medcalc 15.1軟件。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期的相關性采用Spearman相關分析；血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在不同病理學分級和分期之間的差異比較采用單因素方差分析。血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測肝組織不同炎癥活動度和纖維化程度的ROC曲線下面積比較采用成組樣本的Z檢驗。血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量之間的一致性分析采用Pearson直線相關、直線回歸和Bland-Altman一致性分析。血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測肝組織相同炎癥活動度和纖維化程度的ROC曲線下面積之間的差異比較采用配對樣本的Delong非參數檢驗。

結果

一、血清HBV DNA與肝組織病理學分級和分期的相關性

HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期均呈顯著負相關(P均<0.01)。HBeAg陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期均呈顯著正相關(P均<0.01)。見表1。

二、血清HBV DNA在肝組織不同病理學分級和分期之間的差異

HBeAg 陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝組織不同病理學分級和分期之間的差異均有統計學意義(P均<0.05)；其中，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在G2與G3之間，在S1、S2、S3與S4之間的差異有統計學意義(P均<0.05)。HBeAg 陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝組織不同病理學分級和分期之間的差異均有統計學意義(P均<0.05)；其中，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在G1與G2、G3之間，在S1與S2、S3、S4之間，血清HBV DNA(QIAGEN)在S2與S4之間的差異有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表1　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期的Spearman相關系數

表2　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)在肝組織不同病理學分級和分期之間的差異比較(lg IU/mL,±s)

注：a:P=0.036; b:P=0.005; c:P=0.001; d:P=0.004; e:P=0.006; f:P=0.006; g:P=0.009; h:P=0.008; i:P=0.000; j:P=0.000; k:P=0.000; l:P=0.000; m:P=0.018; n:P=0.002; o:P=0.000; p:P=0.006; q:P=0.007; r:P=0.002; s:P=0.000

三、血清HBV DNA預測肝組織不同病理狀態ROC曲線下面積之間的差異

HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測病理學分級≥G2與≥G3的ROC曲線下面積之間的差異無統計學意義(P均>0.05)，預測病理學分期≥S2與≥S3、≥S3與≥S4、S2與≥S4的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)。HBeAg陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測病理學分級≥G2與≥G3的ROC曲線下面積之間的差異無統計學意義(P均>0.05)，預測病理學分期≥S2與≥S3、≥S3與≥S4、S2與≥S4的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

四、血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的一致性

不考慮HBeAg狀態和病理狀態，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)呈顯著正相關(P<0.01)；血清HBV DNA(QIAGEN)(log10IU/mL)=1.111+0.782×血清HBV DNA(COBAS)(log10IU/mL)(P<0.01)，見圖1A。與血清HBV DNA(COBAS)相比，血清HBV DNA(QIAGEN)定量下向偏倚0.165 log10IU/mL，其95%一致限(limits of agreement, LOA)為-2.035～1.705；其中低于95% LOA下限的不一致率為1.44%(4/278)，高于95% LOA上限的不一致率為1.80%(5/278)，總體不一致率為3.24%(9/278)，見圖1B。

表3　血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測肝組織不同病理狀態的ROC曲線下面積

注：*較小的檢測結果表明更加陽性的診斷，#較大的檢測結果表明更加陽性的診斷

注：血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)的測量單位均為log10IU/mL；1A為血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)的相關性；1B為血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的一致性，圖中上、下兩條水平實線代表95 %LOA的上、下限，中間水平實線代表血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)差值的均值，中間水平虛線代表差值均數為0；HBV DNA(QIAGEN)-HBV DNA(COBAS)：血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)的差值；Mean：血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)的均值

圖1血清HBV DNA(QIAGEN)與血清HBV DNA(COBAS)的相關性和一致性

HBeAg 陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的總體不一致率為3.70%(6/162)；其中，病理學分級為G1-2和G3患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分別為4.24%(5/118)和9.09%(4/44)，病理學分期為S1-3和S4患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分別為3.68%(5/136)和7.69%(2/26)。HBeAg 陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的總體不一致率為2.59%(3/116)；其中，病理學分級為G1和G2-3患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分別為6.02%(5/83)和3.03%(1/33)，病理學分期為S1和S2-4患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量的不一致率分別為3.29%(2/61)和3.64%(2/55)。見表4。

五、血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測肝組織相同病理狀態的一致性

HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測相同病理學分級≥G2、≥G3和相同病理學分期≥S2、≥S3、≥S4的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表3，圖2A、2B。HBeAg陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)與血清HBV DNA(COBAS)預測相同病理學分級≥G2、≥G3和相同病理學分期≥S2、≥S3、≥S4的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表3，圖2C、2D。

六、血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測肝組織優選病理狀態的性能比較

HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測病理學分級≥G3的最佳截斷值分別為≤3.981×107IU/mL和≤1.552×108IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.795和0.886、0.500和0.508；預測病理學分期≥S4的最佳截斷值分別為≤3.784×106IU/mL和≤6.668×107IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.654和1.000、0.735和0.581。HBeAg 陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測病理學

表4　HBeAg陽性和陰性患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)的Bland-Altman一致性分析

注：偏倚：HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)差值的均值

注：2A為預測HBeAg陽性患者病理學分級≥G3，2B為預測HBeAg陽性患者病理學分期≥S4；2C為預測HBeAg陰性患者病理學分級≥G2，2D為預測HBeAg陰性患者病理學分期≥S2分級≥G2的最佳截斷值分別為≥5.821×103IU/mL和≥9.311×103IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.970和0.909、0.614和0.651；預測病理學分期≥S2的最佳截斷值分別為≥4.027×103IU/mL和≥3.690×103IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.836和0.873、0.656和0.590。見表5。

圖2　血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測肝組織不同病理狀態的ROC曲線

注：SEN為靈敏度；SPE為特異度；PPV為陽性預測值；NPV為陰性預測值；ACC為準確度

討論

肝組織病理狀態的準確判斷是評估慢性肝病病情和預后的前提，對治療決策和療效評價具有重要的指導意義。近15年來，肝組織病理狀態的無創診斷已經取得許多進展。篩選了一些基于生物學方法的定量血清生物標志和開發了一些基于物理學方法的定量肝臟硬度參數，構建了一些對肝組織病理狀態有預測價值的數學模型[17-20]。雖然預測肝組織炎癥活動度和纖維化程度的靈敏度、特異度和準確度均有所提高，但仍不能滿足讓患者避免有創檢查的需求。

不同病因的慢性肝病，其肝組織病理狀態的演變模式也不完全一致；因此，預測肝組織病理狀態的指標可分為疾病特異性和病因特異性指標。但是，迄今為止，肝組織病理狀態的無創診斷的研究仍主要集中在疾病特異性指標。作為CHB相關的病因特異性指標，血清HBsAg和HBcrAg水平、HBV DNA載量對HBeAg陽性患者、血清HBcrAg水平和HBV DNA載量對HBeAg陰性患者肝組織病理狀態有顯著的預測意義；其中，血清HBsAg和HBcrAg水平、HBV DNA載量對HBeAg陽性患者肝組織病理學分級≥G3和分期≥S4的預測效能最大，血清HBcrAg水平和HBV DNA載量對HBeAg陰性患者肝組織病理學分級≥G2和分期≥S2的預測效能最大。有研究認為，血清HBV DNA<20 000 IU /mL的HBeAg陰性患者很少發生肝組織顯著纖維化[21-22]。Sanai等[23]的研究指出，血清HBV DNA≥2 000 IU/mL和血清HBV DNA≥20 000 IU/mL預測HBeAg陰性患者血清ALT>40 U/L且METAVIR纖維化分期≥F2的靈敏度、特異度分別為51%、80%和42%、86%。

本研究結果顯示，HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期均呈顯著負相關，在G2與G3和S1、S2、S3與S4之間的差異有統計學意義。HBeAg陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)與肝組織病理學分級和分期均呈顯著正相關，在G1與G2、G3和S1與S2、S3、S4之間的差異有統計學意義。雖然血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陽性和陰性患者肝組織病理學分級≥G2與≥G3的ROC曲線下面積之間和預測病理學分期≥S2與≥S3、≥S3與≥S4、S2與≥S4的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義；但血清HBV DNA載量對HBeAg陰性患者病理學分級≥G2的預測效能最大，對HBeAg陽性患者的病理學分期≥S4的預測效能次之。

關于QIAGEN實時PCR和COBAS TaqMan血清HBV DNA定量一致性的研究文獻很少。根據直線相關、直線回歸和Bland-Altman一致性分析，CHB患者血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量具有高度一致性，總體不一致率為3.24%。對基于HBeAg狀態和病理狀態分組的Bland-Altman一致性分析顯示，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)定量均具有較高一致性，HBeAg陽性和陰性患者的不一致率分別為3.70%和2.59%，不同病理狀態的不一致率均<10.00%。根據ROC曲線分析，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陽性和陰性患者相同病理狀態的ROC曲線下面積之間的差異均無統計學意義。說明用于預測肝組織病理狀態目的的血清HBV DNA(QIAGEN)與血清HBV DNA(COBAS)定量具有較高一致性。

HBeAg陽性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)用于預測肝組織病理學分級≥G3的最佳截斷值分別為≤7.600 log10IU/mL和≤8.191 log10IU/mL，兩者之差為-0.591 log10IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.795和0.886、0.500和0.508；用于預測病理學分期≥S4的最佳截斷值分別為≤6.578 log10IU/mL和≤7.824 log10IU/mL，兩者之差為-1.246 log10IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.654和1.000、0.735和0.581。HBeAg陰性患者，血清HBV DNA(QIAGEN)和HBV DNA(COBAS)用于預測肝組織病理學分級≥G2的最佳截斷值分別為≥3.765 log10IU/mL和≥3.969 log10IU/mL，兩者之差為-0.204 log10IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.970和0.909、0.614和0.651；用于預測病理學分期≥S2的最佳截斷值分別為≥3.605 log10IU/mL和≥3.567 log10IU/mL，兩者之差為0.038 log10IU/mL，對應的靈敏度、特異度分別為0.836和0.873、0.656和0.590。提示血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陰性患者肝組織病理學分級≥G2和分期≥S2性能的一致性高于其預測HBeAg陽性患者肝組織病理學分級≥G3和分期≥S4。

本文進一步評價了血清HBV DNA預測CHB患者肝組織病理狀態的效能，同時比較了血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測CHB患者肝組織病理狀態性能的一致性。結果顯示，血清HBV DNA預測HBeAg陰性患者肝組織病理學分級≥G2的效能最大，血清HBV DNA(QIAGEN)與HBV DNA(COBAS)預測HBeAg陰性患者肝組織病理學分級≥G2的性能有較高一致性。

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(本文編輯：錢燕)

Performance comparison between QIAGEN real-time PCR and COBAS TaqMan for serum HBV DNA quantitation in predicting the pathological state of liver tissue from chronic hepatitis B patients

ZHANGZhan-qing,LUWei,WANGPing-an,WANGYan-bing,ZHOUXin-lan,DINGRong-rong,LIXiu-fen,HUANGDan.DivisionTwoofHepatitisDepartment,ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,FudanUniversity,Shanghai201508,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate and compare the performance of QIAGEN real-time PCR and COBAS TaqMan for serum hepatitis B virus (HBV) DNA quantitation in predicting the pathological state of liver tissue from chronic hepatitis B patients. MethodsA total of 278 patients with chronic hepatitis B, including 162 HBeAg-positive and 116 HBeAg-negative ones, were enrolled in this study. Serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) were detected by real-time quantitative PCR and Roche TaqMan COBAS system, respectively. The Scheuer score system used for pathological diagnosis of liver tissue had 5 grades (G0-G4) and 5 stages (S0-S4), respectively. ResultsIn HBeAg-positive patients, there were statistically significant differences of serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) between G2 and G3, S1 and S4, S2 and S4, S3 and S4 (all P<0.05), respectively; in HBeAg-negative patients, there were statistically significant differences between G1 and G2, G1 and G3, S1 and S2, S1 and S3, S1 and S4 (all P<0.05), respectively. Rates of disagreement between serum HBV DNA (QIAGEN) and HBV DNA (COBAS) quantitation of G1-2, G3, S1-3 and S4 in HBeAg-positive patients were 4.24% (5/118), 9.09% (4/44), 3.68%(5/136) and 7.69%(2/26), respectively; and the rates of G1, G2-3, S1 and S2-4 in HBeAg-negative patients were 6.02% (5/83), 3.03% (1/33), 3.29% (2/61) and 3.64% (2/55), respectively. Areas under the receiver operating characteristic (ROC) curves of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G3 and S4 in HBeAg-positive patients were 0.645 and 0.695, 0.703 and 0.755, respectively; and the areas for predicting ≥G2 and ≥S2 in HBeAg-negative patients were 0.848 and 0.817, 0.756 and 0.756, respectively. Optimal cut-offs of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting S4 in HBeAg-positive patients were ≤3.784×106 IU/mL and ≤6.668×107 IU/mL, respectively; and the corresponding sensitivities and specificities were 0.654 and 1.000, 0.735 and 0.581, respectively; and the optimal cut-offs of serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G2 in HBeAg-negative patients were ≥5.821×103 IU/mL and 9.311×103 IU/mL, respectively; and the corresponding sensitivities and specificities were 0.970 and 0.909, 0.614 and 0.651, respectively. ConclusionThe most efficiency of serum HBV DNA for predicting the pathological state of liver tissue is characterized by predicting ≥G2 in HBeAg negative patients, and there is a high consistance of the performance between serum HBV DNA (QIAGEN) and serum HBV DNA (COBAS) for predicting ≥G2 in HBeAg negative patients.

【Key words】HBV DNA quantitation; QIAGEN reagent; Roche TaqMan COBAS system; Chronic hepatitis B; Liver tissue; Pathology

(收稿日期：2015-12-07)

Corresponding author:ZHANG Zhan-qing,Email: doctorzzqsphc@163.com

通信作者：張占卿，Email: doctorzzqsphc@163.com

基金項目：上海市衛計委重點科研項目(20134032)，國家“十二五”科技重大專項(2013ZX10002005)