eIF5A活化因子DHPS在非酒精性脂肪性肝病中的表達及意義

苗琪　卞兆連　王昭月　彭延申　馬雄

200001　上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科，上海市消化疾病研究所

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·論著·

eIF5A活化因子DHPS在非酒精性脂肪性肝病中的表達及意義

苗琪卞兆連王昭月彭延申馬雄

200001上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科，上海市消化疾病研究所

【摘要】目的初步探討真核細胞翻譯起始因子5A (eIF5A)活化因子脫氧輔蛋白合成酶(DHPS)在脂肪肝小鼠模型和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者中的表達及其意義。方法采用免疫組化、Western 印跡、實時 PCR觀察脂肪肝造模小鼠及正常飲食小鼠DHPS的表達情況；HE及油紅染色比較DHPS過表達小鼠與綠色熒光蛋白(GFP)對照組間脂肪造模后肝臟脂肪變性及炎癥程度，PCR-arrays檢測引起差異的相關基因；免疫組化、熒光觀察NAFLD患者肝穿標本及人肝細胞系HL-7702脂肪造模后DHPS的表達。結果脂肪肝模型小鼠較對照組DHPS表達量明顯升高(1.80 比 0.69, P<0.05)，以肝臟(13.21 比 1.00, P<0.01)、脂肪為主(7.97 比 1.00, P<0.01)；DHPS過表達小鼠較GFP對照組在脂肪造模后肝內脂肪變性更明顯(2.78 比 2.20, P<0.05)，其可能與胰島素抵抗(Irs1)、脂肪酸合成增加(Ascbg2)及(iNos、 IL-6)相關；NAFLD患者較健康人群DHPS表達增多(1.29 比 0.50, P<0.05)，且與肝細胞脂肪變性呈正相關(r=0.5927,P=0.018)；人肝細胞系HL-7702脂肪造模后(OP 2:1)DHPS表達顯著升高。結論DHPS在脂肪肝小鼠模型、NAFLD患者及脂肪造模HL-7702中均有高表達，DHPS過表達能加速肝內脂肪沉積，提示其在NAFLD發病中發揮重要作用。

【關鍵詞】真核細胞翻譯起始因子5A；脫氧輔蛋白合成酶；非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征，部分患者會進展至終末期肝病[1-2]。歐美國家成年人患病率可達30%[3]，而我國上海、廣州等發達地區在15%左右[4]。NAFLD 的發病目前尚不能以單一的機制解釋，一般認為是一種遺傳、環境、代謝應激相關性疾病，最為接受的理論是Day和James[5]提出的“二次打擊假說”。真核細胞翻譯起始因子5A (Eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A)是一個高度保守的小分子蛋白(17 kDa)，其活化依賴于脫氧輔蛋白合成酶 (deoxyhypusine synthase，DHPS)和脫氧輔蛋白羥化酶(deoxyhypusine hydroxylase，DOHH)的先后作用[6]。活化后的eIF5A具有翻譯起始、延長等作用。近年來eIF5A及其活化在炎性反應中的作用日益顯現，尤其在糖尿病模型小鼠中敲除eIF5A或抑制DHPS可減輕胰島細胞炎性反應，保護其功能，提高糖耐量水平，這一過程與iNOS的轉錄密切相關[7]。由于NAFLD和糖尿病都是以胰島素抵抗為基礎而引發代謝紊亂綜合征，iNOS在兩種疾病中都高表達[8-9]，推測DHPS在NAFLD發病過程中發揮一定的作用。本研究通過觀察：①脂肪肝造模小鼠DHPS的表達情況；②腺病毒過表達DHPS小鼠與對照組肝臟脂肪變性及炎癥程度；③NAFLD患者肝臟組織學DHPS表達；④人肝細胞系HL-7702脂肪造模后DHPS表達，旨在明確DHPS在NAFLD發病中的作用，為臨床治療提供新的思路。

資料和方法

一、研究對象

6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠購于上海實驗動物中心，飼養于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院動物實驗中心SPF級籠舍。飲食分為高脂飲食(59%脂肪、25%碳水化合物和16%蛋白質)和正常飲食(12%脂肪、59%碳水化合物和29%蛋白質)。8周后高脂小鼠分別予尾靜脈注射PBS溶解的DHPS腺病毒過表達質粒(100 μg/只) 和GFP對照質粒，繼續飼養兩周后處死。腺病毒過表達質粒和對照質粒購于上海和元生物技術公司。所有動物實驗均符合上海交通大學醫學院實驗動物倫理學。

收集2011至2014年期間上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化內科27例NAFLD患者肝組織標本，同時選取8例肝血管瘤切除時瘤旁正常肝組織作為健康對照。 NAFLD診斷參照2012年美國肝臟病學會《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[1]。納入標準：①無飲酒史或乙醇攝入量男性<210 g/周,女性<140 g/周；②肝組織病理學改變符合脂肪性肝病。除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養、肝豆狀核變性、自身免疫性肝病等。肝細胞脂肪變性、小葉內炎癥及肝細胞氣球樣變的評分參照Kleiner DE分級[10]。研究方案經上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院倫理委員會批準，所有納入對象均由本人簽署書面知情同意書。

NAFLD組男15例，女12例，年齡(50.3±12.6)歲，其中單純性脂肪肝9例，NASH 18例；健康對照組男4例，女4例，年齡(48.2±9.8)歲。兩組之間性別構成及年齡差異均無統計學意義。

二、免疫組化染色

石蠟切片70 ℃ 1 h經脫蠟、水化，PBS洗滌3次，3% H2O2作用15 min消除內源性過氧化物酶活性。檸檬酸鹽緩沖液微波修復15 min，自然冷卻至室溫。非免疫羊血清室溫封閉30 min滴加一抗 (抗DHPS抗體，Abcam，1∶100)稀釋。4℃濕盒過夜，次日復溫30 min，PBS 3次，滴加即用型辣根過氧化物酶(HRP)結合二抗，DAB顯色，蘇木精復染，晾干后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察細胞核呈棕褐色者為陽性細胞，在40×10倍鏡下隨機選取5個視野，計數DHPS陽性細胞個數，根據陽性細胞數量分為3級，0級：0個；1級：1～5個；2級：6～10個；3級：>15個。

三、細胞培養及細胞熒光

人肝細胞系HL-7702購于中國科學院上海細胞庫。培養基為 DMEM (美國Invitrogen公司)、10% 胎牛血清(美國Hyclone公司)、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素(美國Invitrogen)。 脂肪造模的試劑為OP 2∶1(油酸和軟脂酸 2∶1混合) 。造模24 h后細胞予以4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton X-100穿透，2% BSA封閉30 min。37 ℃ DHPS一抗孵育60 min，室溫避光二抗(Alexa 488 驢抗兔)孵育30 min。DAPI染核封片，Carl Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡觀察脂肪造模肝細胞DHPS表達情況。

四、實時PCR及PCR array

總RNA采用 TRIzol試劑抽提并且反轉錄為cDNA，于ABI PRISM 7900HT 檢測。β-actin基因作為內參。PCR-array采用384板，BioTNT QPCR染料法premix，ViiATM7實時熒光定量檢測。

五、Western印跡

提取小鼠肝臟組織蛋白，經過電泳、轉膜后一抗DHPS(Abcam，1∶500)孵育過夜，次日孵育二抗后顯色。

六、油紅染色

切片干燥后入50%乙醇稍洗;油紅O乙醇染液作用8 min；50%乙醇分化,自來水終止分化;蘇木素復染核,自來水返藍,甘油明膠封片。

七、統計學方法

結果

一、小鼠高脂飲食誘導肝臟高表達DHPS

高脂飲食組小鼠肝臟內可見大小不一的脂肪空泡。與正常飲食組對比，脂肪肝小鼠肝臟DHPS的表達量明顯升高,主要表達在脂肪變性的肝細胞核，呈棕褐色(圖1A)。Western印跡進一步證實兩組間DHPS的表達差異存在統計學意義(P<0.05，圖1B)。為了明確DHPS的表達是否和胰島素抵抗相關，采用實時PCR分別檢測正常飲食組(n=3)和高脂飲食組(n=3)小鼠肝臟、脂肪和骨骼肌的DHPS RNA表達。結果顯示，正常組和高脂組小鼠肝臟(P<0.01)和脂肪組織(P<0.01)DHPS表達差異均存在統計學意義，而骨骼肌則無統計學意義(P>0.05),提示該基因可能與胰島素抵抗相關(圖1C)。

二、過表達DHPS可加重高脂飲食小鼠肝臟脂肪變性

C57BL/6小鼠給予高脂飲食8周后分別尾靜脈注射DHPS過表達質粒(n=9)和GFP對照質粒(n=5)，再予以高脂飲食2周后分別取肝臟行HE和油紅染色。結果顯示DHPS過表達小鼠肝臟脂肪變性程度顯著高于GFP對照組，DHPS過表達組肝臟小葉內炎癥及氣球樣變程度均高于GFP對照組(圖2A，2B)。

三、過表達DHPS影響的相關基因

選取DHPS過表達小鼠(n=3)和GFP對照小鼠(n=3)行PCR-arrays檢測脂肪肝代謝相關的基因表達。每個基因均比較兩組間表達的倍數(DHPS過表達/GFP對照組)，當比值≥3時考慮為變化明顯。圖3顯示的是變化明顯的基因，通過實時PCR 進一步證實有顯著變化的基因包括iNos，IL-6，Irs1，Ascbg2。

圖1　高脂飲食和對照小鼠DHPS表達情況

圖2　DHPS過表達和GFP對照組高脂飲食肝臟變化

圖3　DHPS過表達和GFP對照組脂肪肝相關基因表達

四、NAFLD患者肝臟DHPS表達情況

結果顯示，與健康對照組相比，NAFLD組肝臟DHPS表達量更多，以脂肪變性的肝細胞為主，細胞核呈棕褐色(圖4A)。組織學上，DHPS陽性的肝細胞與脂肪變性程度呈正相關 (r=0.5927,P=0.018)，與小葉內炎癥及氣球樣變無相關性(圖4B)。這一結果與小鼠體內相似。

五、人肝細胞系HL-7702脂肪造模DHPS表達情況

體外人肝細胞系HL-7702予以OP 2∶1 (油酸和軟脂酸2∶1混合)脂肪造模后可見DHPS在肝細胞核內高表達 (圖4C)。由此可見, 無論體內還是體外DHPS在人脂肪變性的肝臟中均高表達。

討論

DHPS是eIF5A活化過程中的關鍵酶。研究發現，高脂飲食可促進小鼠肝臟DHPS的表達。與GFP對照組相比，過表達DHPS可加重高脂飲食小鼠肝內脂肪沉積，其可能與增加脂肪酸合成、胰島素抵抗和炎性因子的表達相關。此外NAFLD患者和脂肪造模的人肝細胞系HL-7702均可出現DHPS高表達，提示DHPS參與NAFLD的發生。

eIF5A是一個高度保守的小分子蛋白，DHPS和DOHH對于eIF5A均是高度特異的，且DHPS是反應過程中的限速酶[11-14]。最初認為eIF5A和翻譯起始有關[15]，后來又被證實具有翻譯延長功能[16]。此外活化的eIF5A能與某些特定的mRNA結合進而調控其翻譯過程，如： HIV感染的T淋巴細胞mRNA的轉運[17]、樹突狀細胞表面成熟標記CD83mRNA的翻譯[18]、糖尿病小鼠模型Th1細胞表面CD25的表達[19]等 。近年來eIF5A及其活化在炎癥發生過程的作用也日益顯現。抑制eIF5A可減輕脂多糖造模小鼠膿毒素血癥的死亡率，其血清促炎細胞因子和趨化物明顯減少[20]。敲除DHPS雜合子小鼠胚胎成纖維細胞在應激情況下iNOS生成量減少導致炎性反應減弱[21]。Maier等[7]的研究發現，糖尿病小鼠模型敲除eIF5A基因或抑制其活化(DHPS抑制劑)能有效減輕炎癥程度，保護胰島細胞功能，提高糖耐量水平。研究發現，脂肪肝模型小鼠中DHPS過表達組與對照組相比，iNos、IL-6表達明顯升高，肝內炎癥程度亦增加(炎癥評分1.8/1.4)，但差異無統計學意義，其原因在于采用高脂飲食造模，與人NAFLD的發病相似，主要為胰島素抵抗引起肝內脂肪的沉積，而炎癥程度本身就較輕，因此兩組間的差異不夠明顯。

圖4　NAFLD患者及HL-7702脂肪造模后DHPS表達

體內 NO 主要由NOS催化L - 精氨酸生成。肝內NOS有兩種存在形式: 肝細胞、巨噬細胞和白細胞中的誘導型NOS (iNOS)；內皮細胞和血小板中的組成型NOS (eNOS)。在正常情況下，肝組織中主要表達 eNOS，而iNOS無或僅有少量,在各種致病因子誘導下可高表達。iNOS通過增加胰島素抵抗及氧化應激在NAFLD中發病過程中發揮重要作用[8-9]。在糖尿病的發病過程中，各種炎性因子通過NF-κB途徑介導iNOS的轉錄，但iNOS-mRNA出核需要與相關轉運蛋白結合。經DHPS活化的eIF5A與exportin1/CRM1組成的結合體發揮了將iNOS-RNA從核內轉運至核外的作用[7，22]。因此使用DHPS抑制劑能阻礙iNOS蛋白表達進而起到減輕胰島細胞炎癥作用[23]。由于NAFLD和糖尿病發病機制有一定的相似性，推測可能存在相同的機制。

除了炎性因子，脂肪代謝異常沉積、胰島素抵抗也是NAFLD 的重要病因[5]。研究發現，脂肪肝模型小鼠DHPS過表達，其肝內脂肪變性細胞較對照組明顯增多；NAFLD患者中DHPS的表達量與肝細胞脂肪變性的程度成正相關。此外DHPS過表達可上調脂肪酸合成因子Ascbg2、胰島素受體IRS-1的表達，提示DHPS可能通過增加肝內脂肪沉積及胰島素抵抗促進NAFLD的發生。

綜上所述，本研究從細胞、動物和人體組織學水平證實，DHPS與NAFLD發病存在一定的相關性，并對其可能的機制做了初步探索，為治療NAFLD提供新的理論依據。

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(本文編輯：錢燕)

Expression and significance of DHPS,an activating factor of eIF5A,in nonalcoholic fatty liver disease

MIAOQi，BIANZhao-lian，WANGZhao-yue，PENGYan-shen，MAXiong.DivisionofGastroenterologyandHepatology，RenJiHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease，Shanghai200001，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and mechanism of deoxyhypusine synthase (DHPS), an activating factor of eIF5A, in high-fat (HF) diet-fed mice and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) patients. MethodsImmunohistochemistry, western blot and real-time polymerase chain reaction (PCR) were performed to identify the DHPS expression in both HF mice and normal diet-fed (ND) mice. Hematoxylin-eosin (H&E) and oil red staining were conducted between DHPS overexpression group and green fluorescent protein (GFP) control group to compare the degree of liver steatosis and inflammation. In addition, PCR arrays were made to find potential genes related to DHPS. Immunohistochemistry and immunofluorescence were conducted to identify the expression of DHPS in NAFLD patients and HL-7702 cell line modeled with OP 2:1. ResultsHF mice highly expressed DHPS (1.80 vs 0.69, P<0.05), especially in liver (13.21 vs 1.00, P<0.01) and adipose (7.97 vs 1.00, P<0.01) tissue. Mice with overexpression DHPS endured more severe hepatic steatosis compared with mice treated with GFP (2.78 vs 2.20, P<0.05), which might be correlated with Ascbg2, Irs1, iNos and IL-6. Expression of DHPS was more common in NAFLD patients than that in normal controls (1.29 vs 0.50, P<0.05). In histology, the number of DHPS-positive cells was correlated with the degree of steatosis (r=0.5927,P=0.018). HL-7702 treated with OP 2:1 showed higher expression of DHPS. ConclusionExpression of DHPS is significantly increased in HF mice, liver tissue in patients with NAFLD and HL-7702 cell line treated with OP, which suggests an important role of DHPS in the pathogenesis of NAFLD.

【Key words】Eukaryotic translation initiation factor 5A； Deoxyhypusine synthase； Nonalcoholic fatty liver disease

(收稿日期：2015-11-25)

Corresponding author:MA Xiong,Email:maxiongmd@hotmail.com

通信作者：馬雄，Email: maxiongmd@ hotmail.com

基金項目：國家自然科學基金(81200293)