CHB患者Th17-Treg失衡中IL-21的作用及機制

耿建　劉瑞霞　高西陽　李彥　潘修成　傅涓涓　李麗

221002　徐州醫學院附屬醫院感染病科

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·論著·

CHB患者Th17-Treg失衡中IL-21的作用及機制

耿建劉瑞霞高西陽李彥潘修成傅涓涓李麗

221002徐州醫學院附屬醫院感染病科

【摘要】目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周Th17/調節性T細胞(Treg)失衡中IL-21的作用及其初步機制。方法流式細胞儀分別檢測59例CHB患者和20例健康人外周血細胞中Th17細胞和Treg細胞頻數，同時以ELISA法檢測血清細胞因子IL-21、IL-17、IL-10、TGF-β水平。體外分別以IL-21、IL-2刺激CHB患者外周血單核細胞(PBMC)，以實時 PCR 檢測培養細胞轉錄因子RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達水平，以ELISA法檢測培養上清細胞因子IL-17、IL-10和TGF-β水平。結果與正常人群相比，IL-21、IL-17、TGF-β水平顯著升高(P均<0.05)，CHB患者外周Th17/Treg比例顯著升高(P<0.05), IL-21水平與Th17/Treg比例呈正相關(P=0.008)。 與IL-2相比，IL-21刺激CHB患者PBMC的RORγt mRNA表達水平明顯升高(P=0.016)而Foxp3 mRNA表達水平明顯降低(P=0.018),相對應的培養上清中，IL-17水平顯著上升(P=0.049)而IL-10、TGF-β水平明顯降低(P=0.017， P=0.004)。結論CHB患者中IL-21能通過提高RORγt mRNA表達，同時抑制Foxp3 mRNA表達進而促進Th17/Treg失衡。

【關鍵詞】白介素-21；慢性乙型肝炎；Th17細胞；調節性T細胞

既往認為，Th1/Th2平衡失調對慢性乙型肝炎(CHB)發揮重要作用[1]。Th17在CHB的發病中促進炎性反應，主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等細胞因子；而Treg細胞能夠抑制免疫反應，阻止肝組織進一步損傷，主要分泌IL-10、TGF-β、IL-35等細胞因子[2,3]。Th17/Treg比例失衡可能是CHB發病機制中另一重要因素[4,5]。IL-21是近年發現的γc家族細胞因子成員之一，主要由Th17及TFH細胞產生[6]。 IL-21可影響Th17及Treg細胞的產生，可通過干擾foxp3表達而抑制Treg細胞產生，同時通過自分泌途徑誘導Th17細胞的發育。本研究分析IL-21在Th17/Treg失衡中的作用。

資料和方法

一、研究對象

徐州醫學院附屬醫院感染性疾病科2012年7月到2012年12月住院及肝炎門診59例CHB患者，男37例，女22例，年齡(28.5±10.3)歲。ALT為(206±84)U/L，HBsAg為(3.53±0.62) lg IU/mL，HBV DNA為(7.03±0.84) lg IU/mL。診斷標準符合2010年中華醫學會肝病學分會和感染病學分會聯合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》，排除合并其他肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、藥物性肝病、酒精性肝病、肝炎肝硬化等疾病。25名健康對照者來自徐州醫學院附屬醫院健康體檢中心，男17名，女8名，年齡(27.0±8.7)歲。

二、流式細胞儀檢測外周血中Th17、Treg細胞

取上述研究對象外周新鮮無菌肝素抗凝血和RPMI 1640培養液各100 μL混勻，分別加入5 μL 佛波醇酯(2 μg/mL)、5 μL離子霉素 (50 μg/mL)和4 μL布雷菲德菌素(0.5 mg/mL)。 在37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中刺激培養5 h, 取出細胞。流式試管中分別加入PerCP-Cy5.5 抗-人 CD3單抗和FITC 抗-人 CD8單抗各5 μL，再加入100 μL經刺激培養的全血細胞，混勻后室溫避光孵育20 min，加入固定劑100 μL，室溫避光反應10 min，PBS洗滌細胞1次，離心5 min，棄上清液。再加入破膜劑100 μL ，同時加入 PE 抗-人 IL-17A 單抗或者同型對照抗體5 μL，混勻后室溫避光孵育15 min，PBS洗滌，離心后，棄上清。 加入200 μL PBS，上機檢測，分析CD3+CD8-IL-17A+細胞即為Th17細胞頻數。為檢測Treg細胞，另取100 μL肝素化外周新鮮全血加入流式試管中，后加入FITC 抗-人 CD4、PE 抗-人 CD25、AF647 抗-人 CD127各5 μL，充分混勻后，室溫避光孵育30 min。加入2 mL紅細胞裂解液，室溫暗處孵育10 min。室溫1200 r/min，離心5 min，并棄去上清。加入3 mL PBS洗滌液，混勻，1200 r/min，離心5 min，并棄去上清。加入300 μL PBS洗滌液重懸細胞后流式細胞儀檢測。以上流式抗體均為美國eBioscience公司產品。

三、外周淋巴細胞分離和細胞培養

取CHB患者外周抗凝靜脈血5 mL，取等體積的淋巴分離液加入無菌離心管中，將血液沿管壁加入淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min離心20 min；取中間白膜層，加入適量PBS液洗滌1～2次。用含10%胎牛血清RBMl 1640培養液重懸細胞。將重懸細胞分成3組，IL-2組、IL-21組及PBS對照組，培養48 h后,分別收集培養上清及細胞備檢測。

四、細胞因子檢測

收集研究對象外周血清和上述細胞培養上清，采用ELISA法測定IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平。IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D公司。

五、RORγt和Foxp3 mRNA表達水平測定

用Trizol法抽提收集培養細胞總RNA，加入適量的無核酶水將RNA稀釋為1 μg/μL。根據GenBank中人RORγt及Foxp3基因序列，利用Primer 5.0軟件設計出引物：RORγt正向引物5′- AGATACC-CTCACCTACACCTTG -3′，反向引物5′-CCGCTC-AGGGCTGTATTCAA-3′；Foxp3正向引物5′- TGACCAAGGCTTCATCTGTG -3′，反向引物5′- GAACTCTGGGAATGTGCTGTT -3′；GAPDH作為內參對照，正向引物5′- GGGAAACTGTGGCGT-GAT - 3′，反向引物5′- GAGTGGGTGTCGCTGTT-GA -3′。反轉錄條件按照試劑盒說明書進行，取2 μL得到的cDNA模板進行檢測，操作方法參考實時PCR試劑盒說明書，反應條件：95 ℃ 3 min預變性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環。熔解曲線設定95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應結束后確認實時PCR擴增曲線和熔解曲線以及分析擴增基因表達情況。RORγt及Foxp3 mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。

六、統計學方法

結果

一、CHB患者外周血Th17、Treg細胞頻數及Th17/Treg的比值

采用流式細胞儀測定外周血中Th17、Treg細胞頻數，結果如圖1所示，與健康對照(1.62±0.71)%相比，CHB患者外周血中Th17頻數(2.69±1.44)%顯著升高，而Treg頻數無顯著差異；CHB患者中Th17/Treg比值顯著高于健康對照。

二、CHB患者外周血清IL-21水平與Th17/Treg相關關系

相關關系分析表明，CHB患者外周血清IL-21濃度分別與外周血Th17/Treg細胞呈正相關(r=0.380，P=0.008)，見圖2，而IL-10、IL-17、TGF-β水平與Th17/Treg比例無明顯相關性。

注：1A.Th17細胞流式圖；1B.Treg細胞流式圖

圖2　CHB患者外周血中Th17/Treg與IL-21水平關系

三、CHB患者外周血清IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平

CHB組血清IL-21為(42.34±34.78) pg/mL、IL-17為(26.60±37.97) pg/mL、TGF-β為(24 726±11 235.81) pg/mL，均明顯高于健康對照組的(17.1±11.09)、(7.71±7.62) pg/mL(P=0.002)和(18 249.03±7 603.58) pg/mL(P=0.030)。CHB組血

清IL-10(34.12±33.32) pg/mL高于健康對照組的(25.94±27.01) pg/mL，但差異無統計學意義(P>0.05)。

四、CHB患者的IL-21對PBMC 中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達的影響

與IL-2和PBS相比，CHB患者的IL-21使RORγt mRNA表達水平顯著升高，而Foxp3 mRNA表達水平顯著降低。見圖3。

五、CHB患者的IL-21對PBMC 生成細胞因子IL-17、TGF-β及IL-10的影響

各試驗組PBMC培養上清中IL-17水平，與IL-2組(16.60±6.00) pg/mL和PBS組(10.61±6.09) pg/mL相比，IL-21組IL-17(41.24±20.36) pg/mL水平顯著升高(P=0.049，P=0.018)；與IL-2組IL-10 (161.97±65.16) pg/mL或TGF-β(8 979.20±1 580.19) pg/mL相比，IL-21組IL-10(58.75±45.62) pg/mL或TGF-β(6 763.40±921.57)水平顯著下降(P=0.017，P=0.040)。見圖4。

圖3　CHB患者的IL-21對PBMC中RORγmRNA和FOXp3mRNA表達的影響

圖4　CHB患者的IL-21對PBMC產生IL-10、IL-17及TGF-β水平的影響

討論

介導免疫耐受的Treg細胞和介導炎性反應的Th17細胞之間功能和分化過程相互對抗，正常狀態下兩者保持平衡，如果Th17/Treg失衡，將引起全身或局部免疫應答異常。與已報道的研究結果一致[4,5,7]，本研究結果顯示，CHB患者Th17/Treg比例顯著高于正常人群水平，出現失衡狀態。提示與Treg相比，CHB患者處于一種Th17細胞增多并趨于優勢地位的炎性狀態，這可能是導致肝臟炎性反應的重要因素。

細胞因子在CD4+T淋巴細胞向Treg、Th17細胞分化過程中發揮關鍵作用，TGF-β能促進Treg細胞分化，分泌IL-10、TGF-β及FoxP3表達，而在TGF-β、IL-6及IL-21作用下則促進Th17細胞分化、生成，進而分泌IL-17、IL-23及IL-21等細胞因子[8]。

IL-21是初始CD4+T淋巴細胞向Th17細胞分化和發育過程中必要的細胞因子，同時還可以通過自分泌促進Th17的發育[9]。研究表明，CHB狀態下IL-21對HBV感染發揮免疫控制的作用，IL-21可以通過維持HBV特異性CTL細胞功能及促進HBV特異性體液免疫功能控制HBV感染[10-11]。同時，外周血IL-21水平與CHB疾病進展特別是重癥肝炎病情嚴重程度密切相關[12-14]。本研究結果顯示CHB患者外周血IL-21、IL-17、TGF-β水平明顯高于正常人群，并且IL-21與Th17/Treg顯著正相關，提示IL-21不僅是重要的炎性因子，還可能是TH17/Treg比例失調的重要原因。

鑒于IL-21對Th17及Treg的分化及發育過程均有影響，為進一步研究IL-21在CHB患者中Th17/Treg失衡中的作用，以IL-21體外刺激CHB患者PBMCs,并對Th17、Treg各自特異性轉錄因子RORγt和Foxp3的mRNA水平進行定量檢測，結果顯示IL-21能顯著促進RORγt mRNA表達而降低Foxp3 mRNA表達水平，相對應培養上清中細胞因子的檢測中發現，與IL-2相比，IL-21能促進IL-17表達而降低IL-10及TGF-β水平；提示Il-21能通過促進RORγt mRNA表達及抑制Foxp3 mRNA表達調控Th17/Treg，從而導致Th17與Treg細胞比例失衡。

綜上分析，本研究在發現CHB患者存在Th17/Treg失衡的基礎上，通過體外試驗證實了IL-21能促進CHB患者外周血Th17細胞的轉錄因子RORγt的表達，提高了Th17細胞的活性，同時抑制了Treg細胞的分化，在CHB發病機制中發揮重要作用，這為今后通過調控Th17/Treg失衡進而延緩CHB病情進展的治療提供了理論和實驗依據。

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(本文編輯：錢燕)

The role of interleukin-21 in Th17/Treg imbalance in patients with chronic hepatitis B

GENGJian,LIURui-xia,GAOXi-yang,LIYan,PANXiu-cheng,FUJuan-juan,LILi.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalColleague，Jiangsu221002，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of interleukin-21 in T helper cell 17 (Th17)/regulatory T cells (Treg) imbalance in chronic hepatitis B (CHB) patients, and its mechanism. MethodsFrequencies of Th17 cells and Treg in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 76 CHB patients and 20 health controls were detected by flow cytometry, and serum levels of interleukin (IL)-21, IL-17, transforming growth factor (TGF)-β and IL-10 were measured by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). Under stimulation of IL-21 or IL-2 in vitro, levels of RORγt and Foxp3 mRNA in PBMCs were detected by real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and levels of IL-17, IL-10, TGF-β in supernatants were determined by ELISA assay, respectively. ResultsThe level of IL-21 was positively associated with the ratio of Th17 to Treg, which was significantly enhanced in CHB patients when compared with that in health controls (P<0.05). In IL-21 stimulated PBMCs of CHB patients, the expression of RORγt mRNA was significantly increased (P=0.016), while the expression of Foxp3 mRNA was obviously decreased (P=0.018), comparing with those in IL-2 stimulation group. Additionally, level of IL-17 in the corresponding supernatants was notably enhanced (P=0.049), while levels of IL-10 and TGF-β were decreased significantly (P=0.017, P=0.004), respectively. Conclusion IL-21 could enhance the ratio of Th17 to Treg through increasing the expression of RORγt mRNA and decreasing the expression of Foxp3 mRNA in patients with CHB.

【Key words】Interleukin-21; Chronic hepatitis B; Th17 cell; Regulatory T cell

(收稿日期：2015-11-04)

Corresponding author:PAN Xiu-cheng, Email: xzpxc68@126.com

通信作者：潘修成，Email：xzpxc68@126.com

基金項目：江蘇省臨床醫學科技專項 (BL2012043)