鋅α2糖蛋白對實驗性大鼠肝癌的抑制作用

廖紅雨　于景霞　劉婷　陸倫根　徐銘益

856000　西藏　西藏山南扎囊縣吉汝鄉衛生院(廖紅雨)；上海交通大學附屬第一人民醫院消化科(于景霞，劉婷，陸倫根，徐銘益)

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·論著·

鋅α2糖蛋白對實驗性大鼠肝癌的抑制作用

廖紅雨于景霞劉婷陸倫根徐銘益

856000西藏西藏山南扎囊縣吉汝鄉衛生院(廖紅雨)；上海交通大學附屬第一人民醫院消化科(于景霞，劉婷，陸倫根，徐銘益)

【摘要】目的探討鋅α2糖蛋白(AZGP1)與肝細胞癌(HCC)發生、發展和轉移的關系。方法二乙基亞硝胺(DEN)構建肝硬化和HCC大鼠模型，以過表達AZGP1基因干擾的HepG2細胞液構建裸鼠皮下成瘤和肝原位移植模型。免疫組織化學、蛋白免疫和PCR檢測AZGP1和TGFβ1的表達。結果AZGP1 mRNA在正常肝組織、肝硬化和肝癌中的表達分別為(0.98±0.02)、(0.52±0.03)、(0.20±0.02)；而TGFβ1的基因和蛋白表達在肝硬化和肝癌組織中呈現顯著上調。AZGP1過表達的HepG2細胞接種裸鼠構建皮下腫瘤(HepG2-AZGP1組)。與對照組(HepG2-GFP組)比較，腫瘤大小無差異。裸鼠肝內移植術6周后，HepG2-GFP組57%和HepG2-AZGP1組14%發生肺轉移(P=0.0157)。與HepG2-GFP組比較，HepG2-AZGP1組肝臟原發灶和肺轉移灶結節數目明顯減少，癌細胞異型性明顯較輕。結論肝硬化進展至肝癌過程中抑癌基因AZGP1發生缺失，伴隨著失去阻抑TGFβ1作用。恢復AZGP1功能可能是一種新的有前途的治療肝癌方法。

【關鍵詞】肝細胞肝癌；肝硬化；鋅α2糖蛋白；轉化生長因子β1

鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein 1，AZGP1)的相對分子質量為40×103，主要在上皮細胞表達，可抑制腫瘤生長，抑制酶介導的腫瘤浸潤，激活細胞凋亡[1，2]。已發現AZGP1可抑制轉化生長因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)介導的上皮間質轉化(EMT)而抑制胰腺腫瘤的侵襲 ，而AZGP1在肝癌中的作用機制尚未明確。本研究擬闡明實驗性大鼠HCC模型中，AZGP1的表達和對HCC的影響作用。

資料和方法

一、實驗動物

60只健康雄性SD大鼠，SPF 級，體質量180～220 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，飼養于上海交通大學醫學院實驗動物中心，所有動物自由進食飲水，溫度濕度符合標準。每日飲水中加入0.05 g/L的二乙基亞硝胺(DEN，美國Sigma公司)誘導肝硬化及肝癌大鼠模型。造模后分別在0、8、12、16周處死大鼠，設立對照組、肝硬化組、晚期肝硬化組和肝癌組，每組15只。

二、細胞株及試劑來源

HepG2細胞株，HEK293T細胞株，購自中科院上海細胞庫。30只雄性BALB/c裸鼠(4～6周齡)，購自上海中科院實驗動物中心。胎牛血清、0.25%胰酶、RPMI1640培養液(美國Gibco公司)，雙抗和PBS(美國Hyclone公司)，Opti-MEM 和Lipofectamine 2000(美國Life Technologies公司)，Polybrene(美國Sigma公司)，pLenti-AZGP1載體(含有mGFP標記)及對照空載體(美國Origene公司)，慢病毒包裝試劑盒(美國Origene公司)。

三、皮下成瘤試驗

應用Lipofectamine 2000轉染試劑將慢病毒表達質粒pLenti-AZGP1與慢病毒包裝試劑盒共轉染293T細胞進行重組慢病毒包裝及陰性對照載體病毒液。取對數生長期的HepG2細胞接種在培養皿中，加入病毒液感染細胞，加入終濃度8 μg/mL的Polybrene，搖勻后37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養，24 h后根據細胞狀態適時更換新鮮完全培養基，待細胞長至80%～90%匯合時，傳代擴增培養，流式細胞儀分選熒光強度高的穩定細胞。隨機選取4～6周齡雄性 BALB/c 裸鼠16只，分為兩組(每組8只)，分別注射AZGP1過表達或對照空載體轉染的HepG2細胞液。細胞液搖勻后，在裸鼠雙側下肢髖關節上方皮下分別接種5×106/0.2 mL細胞懸液。觀察皮下腫瘤生長，4周時，斷頸處死裸鼠稱重。

四、肝原位移植

14只6周齡裸鼠分別以AZGP1過表達的HepG2細胞接種的皮下腫瘤(HepG2-AZGP1組，n=7)和空載體轉染HepG2細胞接種的皮下腫瘤(HepG2-GFP組，n=7)行肝內移植術，取長至約1 cm皮下瘤，去除壞死組織剪成1～2 mm3小塊。HepG2-AZGP1組7只小鼠，用戊巴比妥鈉腹腔麻醉，皮膚消毒后行左上腹橫開口，暴露肝臟，取上述2塊瘤組織，在離體30 min內用針頭植入裸鼠肝葉深部實質內，壓迫止血后全層關腹。完成肝內移植后，裸鼠放回籠中SPF條件飼養，自由飲食，并觀察裸鼠生活狀況。手術6周后，處死裸鼠，取肝臟、肺組織行HE染色。

五、免疫組化

采用即用型免疫組織化學超敏Ultra SensitiveTM SP 試劑盒(美國ZYMED公司)，參考說明書進行。切片依次經下述處理：組織脫蠟；水化；PBS浸泡；滴加阻斷劑；抗原修復；使用非免疫血清封閉；滴加AZGP1和TGFβ1一抗(美國Abcam公司)，4 ℃過夜；滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(稀釋度1∶200)，37 ℃ 10 min；DAB顯色，蘇木素復染(美國Sigma公司)。

六、熒光定量PCR

采用反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，RNA抽提采用TRI REAGENT○RRNA提取試劑盒(美國Molecular Research Center)，按說明書進行，DEPC(焦碳酸乙二酯，美國Sigma公司)，氯仿、無水乙醇、異丙醇(上海國藥集團)，RNA定量及電泳，電泳后見28S及18S兩條條帶，且28S:18S比值大于2。總RNA反轉錄，根據M-MLV操作說明書進行。應用Primer 5.0，設計檢測基因引物，內參基因為β-Actin。引物(上海生工)，各引物序列見表1。SYBR Green摻入法熒光定量PCR反應體系。熒光定量PCR：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；55 ℃，1 min；循環40次。樣品目的基因的相對表達率 (Relative Expression，RQ)采用△△CT方法計算，RQ=2-△△CT。RNA熒光定量PCR拷貝數，根據標準曲線獲得。每個樣品的目的基因與內參照基因各設3個重復試驗。

表1　PCR引物序列

七、Western印跡

WB采用RIPA細胞裂解液(美國Santa Cruz公司)，BCA蛋白質定量試劑盒(上海生工)，硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)，丙烯酰胺、SDS(美國Sigma公司)，TEMDE(美國Sigma公司)，甘氨酸、濾紙(美國Promega公司)，抗體(美國Abcam公司)。

八、統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件。各組數據以均數±標準差表示，兩組數據間比較采用獨立樣本t檢驗，三組以上數據間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

一、肝硬化、肝癌大鼠組織中AZGP1 mRNA和TGFβ1 mRNA表達

圖2　各組大鼠肝組織免疫組化結果(×200)

AZGP1mRNA表達水平，在肝硬化組(0.52±0.03，P=0.0467)和晚期肝硬化組(0.38±0.01，P=0.0204)中較正常肝組織明顯下調，在肝癌組(0.20±0.02，P=0.003)中的表達較其他組均顯著下調。TGFβ1mRNA表達在肝硬化組(2.24±0.09，P=0.0370)和晚期肝硬化組(3.14±0.21，P=0.0251)中較正常肝組織明顯上調，在肝癌組(1.98±0.02，P=0.0412)中比正常肝組織也呈顯著上調，但低于肝硬化組。

二、肝硬化、肝癌大鼠肝組織中AZGP1和TGFβ1蛋白表達

AZGP1的蛋白表達在肝硬化組織中較正常肝組織明顯減低，在肝癌組織中的表達較其他組均明顯降低。而TGFβ1蛋白表達在肝硬化組中較正常肝組織明顯升高，在肝癌組織中表達接近或低于正常組織(圖1)。

AZGP1在正常肝組織中呈強陽性表達，在肝硬化和晚期肝硬化組織中表達逐漸變弱，在肝癌組織中呈弱表達或幾乎陰性表達。TGFβ1在肝癌組織的表達強于正常肝組織，但比肝硬化組織顯著減弱；而肝硬化組織中TGFβ1蛋白的表達較正常肝組織強，晚期肝硬化組織中表達最強(圖2)。

圖1　Western印跡法檢測AZGP1蛋白的表達

三、裸鼠體內成瘤試驗

AZGP1過表達的HepG2細胞液注射形成的皮下腫瘤，HepG2-AZGP1組為(1.77±0.42) g，與HepG2-GFP組的(2.05±0.35) g比較，腫瘤大小差異無統計學意義(P=0.075)，表明AZGP1對腫瘤生長沒有顯著影響。

四、裸鼠體內轉移試驗

每組7只裸鼠中，對照HepG2-GFP組有4只發生肺轉移，HepG2-AZGP1組有1只發生肺轉移(P=0.0157)。肝臟病理大體觀察可見，兩組小鼠肝臟均可見灰白色粟粒狀結節，大小不等，分散分布，HepG2-AZGP1組結節數目明顯比對照組少。光鏡檢查可見，兩組肝癌細胞均呈胞核大而不規則，分裂相多，細胞排列不規則，HepG2-AZGP1組肝癌細胞異型性明顯較對照組輕。肺轉移灶病理大體形態觀察HepG2-AZGP1組結節數目大小明顯比對照組少；HE染色光鏡觀察也可見與對照組相比，肺內轉移灶HepG2-AZGP1組瘤細胞形態小，異形性輕(圖3)。

圖3　裸鼠肝原位移植6周后肝臟和肺臟鏡下表現(HE，×100～200)

討論

AZGP1與多種腫瘤的發生發展相關，在腫瘤性疾病中呈異常低表達，可以定義為抑癌基因，在人肝癌組織中也可見AZGP1基因表達缺失，其與HCC預后密切相關[3-6]。本研究觀察大鼠肝癌、肝硬化和正常肝組織中AZGP1 mRNA和蛋白的表達差異，證實AZGP1在正常肝臟呈高表達，肝硬化時AZGP1表達顯著降低，肝癌時AZGP1表達缺失呈最低。AZGP1的表達異常伴隨TGFβ1在大鼠肝硬化或肝癌中極度活化表達上調。TGFβ1是纖維化促發因素，參與了肝硬化發生發展的全過程；在HCC時TGFβ1也能誘導EMT發生，所以TGFβ1在肝炎、肝硬化至肝癌的過程中都發揮了重要調節作用。

腫瘤侵襲和轉移是影響腫瘤生存的主要因素。 在腫瘤侵襲和轉移的過程中,血管形成和EMT扮演著重要的作用。肝癌是富血管性腫瘤,且微血管生長增加,腫瘤細胞得以不斷增殖和轉移；在EMT 過程中,上皮細胞極性的喪失和間質特征的獲得為主要特點。體外研究證實，AZGP1可上調上皮細胞標志物 E-cadherin 的表達,使得細胞之間的連接加強；而間質細胞標志物 Vimentin 的表達降低,導致腫瘤細胞發生轉移減少。在本研究中制備了過表達AZGP1的病毒包裝載體，可干擾受體的AZGP1過表達，結果也驗證了其可以顯著抑制HCC的遠處肺轉移。雖然體內裸鼠試驗在過表達AZGP1組和對照組的移植瘤和肝原發腫瘤無明顯差異，但也觀察到了肝原發腫瘤的癌結節大小和范圍比對照組小。

總之，肝硬化進展至肝癌過程中抑癌基因AZGP1發生缺失，伴隨著失去阻抑TGFβ1作用，恢復AZGP1功能可能是一種新的治療肝癌方法。

參考文獻

1Zorin NA, Zorina VN, Zorina RM. Role of proteins of the macroglobulin family in regulation of tumor growth. Ontogenez, 2006, 37: 12-19.

2Zorin NA, Zorina VN, Zorina RM. The role of macroglobulin family proteins in the regulation of inflammation. Biomed Khim, 2006, 52: 229-238.

3Hassan MI, Waheed A, Yadav S, et al. Zinc alpha 2-glycoprotein: a multidisciplinary protein. Mol Cancer Res, 2008, 6: 892-906.

4Irmak S, Tilki D, Heukeshoven J, et al. Stage-dependent increase of orosomucoid and zinc-alpha2-glycoprotein in urinary bladder cancer. Proteomics, 2005, 5: 4296-4304.

5Abdul-Rahman PS, Lim BK, Hashim OH. Expression of high-abundance proteins in sera of patients with endometrial and cervical cancers: analysis using 2-DE with silver staining and lectin detection methods. Electrophoresis, 2007, 28: 1989-1996.

6Huang Y, Li LZ, Zhang CZ, et al. Decreased expression of zinc-alpha2-glycoprotein in hepatocellular carcinoma associates with poor prognosis. J Transl Med, 2012, 10:106.

(本文編輯：錢燕)

Inhibition of zinc-2 glycoprotein in a rat model of hepatocellular carcinoma

LIAOHong-yu，YUJing-xia，LIUTing，LULun-gen，XUMing-yi.Jirutownshiphospital,Zhanangcountry,ShannanprefectureofTibetautonomousregion856000,China；DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople’sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of zinc-α2-glycoprotein (AZGP1) in a rat model of hepatocellular carcinoma (HCC), and its relationship with HCC progression. MethodsCirrhosis and HCC in rat models were established by diethylnitrosamine (DEN) water feeding, and subcutaneous tumor and orthotopic liver transplantation models in nude mice were constructed by injection of HepG2 cells with AZGP1 gene over-expressed interferenced vector. The expressions of AZGP1 and transforming growth factor β1 (TGFβ1) were detected by immunohistochemistry staining, westernblot (WB) and polymerase chain reaction (PCR), respectively, then the relationship among AZGP1, tumor size and metastasis rate was evaluated. ResultsThe level of AZGP1 mRNA (0.20±0.02, p=0.003) was lower in HCC tissues than that in normal or cirrhosis tissues. Hepatic expression of AZGP1 proteins was absent or low-expressed, which was confirmed by quantitative immunohistochemical and WB analysis. Hepatic TGFβ1 gene and protein in cirrhotic and HCC tissues were significantly increased. The size of subcutaneous tumors had no difference between AZGP1 over-expressed HepG2 cells treated group (HepG2-AZGP1 group) and the control group (HepG2-GFP group). The incidence of lung metastasis was 57% in HepG2-AZGP1 group and 14% in HepG2-GFP group at week 6 after transplantation of subcutaneous tumors in nude mice. Compared with those in HepG2-GFP group, the numbers and sizes of tumor nodules in liver and lung were significantly decreased and the distinct atypia degrees of cancer cells were significantly lower in HepG2-AZGP1 group. ConclusionDuring the progression from cirrhosis to HCC, AZGP1 loss occurred accompanied with derepression of TGFβ1, which was proposed that function recovery of AZGP1 might be a new promising approach to reversing HCC.

【Key words】Hepatocellular carcinoma (HCC); Zinc-α2-glycoprotein 1 (AZGP1); Transforming growth factor-β1 (TGF-β1); Cirrhosis

(收稿日期：2015-12-25)

Corresponding author:XU Ming-yi，Email: xumingyi2014@163.com

通信作者：徐銘益，Email：xumingyi2014@163.com

基金項目：國家科技部“十二五”重大專項(2013ZX10002004-002-003)，國家自然基金面上項目(81570547),院優秀青年培養計劃(061405)