抵當湯對糖尿病大鼠心肌組織JAK2/STAT3信號通路的影響

張　凱，儲全根，畢華劍，劉新萍，吳元潔，周雪梅，劉德勝，董妍妍

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥　230012)

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抵當湯對糖尿病大鼠心肌組織JAK2/STAT3信號通路的影響

張凱，儲全根，畢華劍，劉新萍，吳元潔，周雪梅，劉德勝，董妍妍

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥230012)

[摘要]目的探討抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的影響。方法單次注射鏈脲佐菌素復制糖尿病大鼠模型，將糖尿病大鼠隨機分為模型組、抵當湯組、桃仁大黃組、水蛭虻蟲組和纈沙坦組，以正常雄性SD大鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，其余各組大鼠接受相應藥物灌胃，連續8周。采用Western blot法檢測心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、心肌組織JAK2和STAT3蛋白表達，采用實時熒光定量PCR法檢測JAK2、STAT3 mRNA表達。結果與正常對照組比較，模型組ANP、JAK2、STAT3蛋白以及JAK2、STAT3 mRNA表達水平均顯著上調(P<0.05)。水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達的主效應均具有統計學意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無統計學意義(P>0.05)。水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對糖尿病大鼠心肌組織JAK2、STAT3 mRNA表達的交互作用具有統計學意義(P<0.05)。纈沙坦組、抵當湯組及兩個抵當湯拆方組ANP、JAK2蛋白及JAK2 mRNA表達水平比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論抵當湯延緩糖尿病大鼠心肌細胞肥大的機制與抑制JAK2/STAT3信號通路有關，其拆方對JAK2、STAT3 mRNA表達的效應存在相互影響。

[關鍵詞]糖尿病；心肌細胞肥大；抵當湯；JAK2/STAT3信號通路

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是獨立于高血壓及冠狀動脈粥樣硬化，而直接由糖尿病導致心肌損害的一種臨床疾病，是糖尿病的重要并發癥和主要死因[1]。心肌細胞肥大為其主要病理特征之一。Janus激酶-信號轉導子與轉錄激活子(janus activated kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)這一信號通路和心肌細胞肥大的關系十分密切[2-3]。

抵當湯具有化瘀瀉熱通絡的功效，符合DCM病變脈絡瘀阻的病機，臨床及基礎研究中，有較多的用于糖尿病及其并發癥的防治[4-6]。在前期研究[7]中已經發現，抵當湯能夠顯著抑制糖尿病引起的心肌病變。本研究通過復制糖尿病模型，應用具有化瘀瀉熱通絡作用的中藥抵當湯及其拆方逐瘀通絡水蛭虻蟲煎劑、化瘀瀉熱桃仁大黃煎劑對DCM進行早期干預，以血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ受體阻滯劑纈沙坦為陽性對照藥，觀察各組大鼠心肌組織心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)水平，以及JAK2、STAT3蛋白及其mRNA的表達水平，探討抵當湯及其兩組拆方對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的干預作用。

1材料

1.1實驗動物雄性SD大鼠115只，清潔級，體質量200～240 g，購于安徽醫科大學動物實驗中心，生產許可證號為SCXK(皖)2011-002。

1.2藥物抵當湯方由桃仁25 g，制大黃15 g，水蛭、虻蟲各10 g組成，購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥房。首次以10倍量水浸泡2 h，煮沸1 h，次煎以8倍量水煮沸1 h，之后合并2次濾液，再以文火濃縮使之含生藥3 g/mL；其后再分別稱取桃仁25 g、制大黃15 g為桃仁大黃組，水蛭、虻蟲各10 g為水蛭虻蟲組，煎煮方法、生藥含量均與抵當湯相同，即得桃仁大黃煎液和水蛭虻蟲煎液。裝瓶后保存于0～4 ℃冰箱。纈沙坦膠囊為北京諾華制藥有限公司產品，批號為國藥準字H20040217，每粒80 mg，使用前用蒸餾水配制成混懸液。

1.3試劑和儀器鏈尿佐菌素(每支100 mg，批號 20130320546)：購自美國Sigma公司；10%水合氯醛(批號 20120210)：購自上海蘇懿化學試劑有限公司；Trizol試劑(批號 14105)：購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒(批號 00145205)：購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀、PikoReal 96熒光定量PCR儀：美國Thermo公司。

2方法

2.1糖尿病模型復制SD雄性大鼠115只，適應性喂養7 d，其中105只用于糖尿病模型復制。在實驗前統一檢測所有大鼠血糖，確保每只大鼠血糖值均在3.0～5.0 mmol/L范圍內。根據課題組之前的模型復制方法[8]，一次性腹腔注射鏈尿佐菌素55 mg/kg，復制糖尿病大鼠模型，繼續喂養3周后可出現明顯的糖尿病心肌病變。同時為防止大鼠因血糖值過低而死亡，所有大鼠均給予5%葡萄糖飲水。在模型復制48 h后，開始給予自來水飲用；72 h后，尾靜脈取血，檢測隨機血糖，以隨機血糖大于16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠模型復制成功的標準。將模型復制成功的100只大鼠按體質量區組隨機分為5組：模型組、抵當湯組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和纈沙坦組，每組20只。從剩下的15只血糖水平正常的大鼠中選取10只作為正常對照組。

2.2給藥方法模型復制成功后第2天開始給予灌胃給藥。將保存備用的水蛭虻蟲煎劑、桃仁大黃煎劑、抵當湯煎劑分別用蒸餾水配成1.0 g/mL的3組溶液，各中藥組大鼠均按每日10 mL/kg接受灌胃給藥。纈沙坦組大鼠接受纈沙坦混懸液(每日80 mg/kg)灌胃給藥；正常對照組和模型組大鼠分別接受等容量蒸餾水灌胃。連續8周。

2.3取材末次灌胃后，將所有大鼠禁食10 h，再稱其體質量，用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉，迅速剖開胸腔，取出心臟，剪取左心室心肌組織約0.5 cm×0.5 cm，凍存于-80 ℃冰箱待檢。

2.4Western blot法檢測心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達取大鼠心肌組織，用Trizol試劑提取組織蛋白質，用Bradford方法測定蛋白質含量。將提取的等量蛋白質加入2倍加樣緩沖液，煮沸10 min后冷卻，上樣到SDS-PAGE加樣孔內，垂直電泳，然后將蛋白質轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，滴加稀釋的一抗，TBST洗脫后，滴加二抗，再TBST洗脫，用化學發光劑溫浴1 min后曝光、顯影和定影，最后掃描，對條帶灰度進行分析，以目的蛋白與內參蛋白β-actin的灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.5實時熒光定量PCR法檢測JAK2、STAT3 mRNA表達取凍存的心肌組織，置于離心管中，用Trizol法抽提RNA。取RNA樣品3 μg以oligo(dT)進行逆轉錄反應，合成cDNA。引物及內參照均由Invitrogen公司合成。目的基因JAK2上游引物：5′-TATACTATGGAAACTTGGAGTGGCC-3′，下游引物：5′-AATGTCCTTTGGTAGAACTGTGATG-3′；Stat3上游引物：5′-GAGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3′，下游引物：5′-CAGGTCGTTGGTGTCACACA-3′；內參β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。取出上述cDNA反應液1 μL作為熒光定量的模板，進行PCR擴增，總反應體系10 μL：內含2倍SYBR格林混合液5 μL，上游引物10 μmol/L 1 μL，下游引物10 μmol/L 1 μL，模板DNA 1 μL，無水RNA酶2 μL，置于實時熒光儀中進行擴增。反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。PCR反應產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察拍照，計算目的基因與內參照基因條帶的密度比值，作為目的基因的相對表達水平。

3結果

3.1模型因素對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達的影響與正常對照組比較，模型組ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1和圖1。

3.2抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響以模型組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和抵當湯組作為實驗組合進行兩因素析因設計的方差分析，結果顯示水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT2的主效應均具有統計學意義(P<0.05)，兩個拆方的交互作用均無統計學意義(P>0.05)。見表2。結果提示，水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方均可顯著降低糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3表達水平，尚不能認為水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對這3種蛋白的表達具有協同或拮抗作用。

3.3抵當湯及其拆方和纈沙坦對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響以水蛭虻蟲組、桃仁大黃組、抵當湯組和纈沙坦組為實驗組合進行單因素方差分析，結果顯示4組糖尿病大鼠心肌組織ANP和JAK2蛋白表達水平比較，差異具有統計學意義(ANP：F(3，8)=10.90，P=0.003；JAK2：F(3，8)=8.39，P=0.007)；4組STAT3表達水平比較，差異無統計學意義(F(3，8)=2.16，P=0.171)。多重比較發現，纈沙坦對ANP表達的效應與抵當湯相當(P>0.05)，而對JAK2表達的效應與水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方相當(P>0.05)，對STAT3表達的效應與抵當湯全方及其拆方均相當(P>0.05)。見表1。

表1　各組糖尿病大鼠ANP、JAK2和STAT3蛋白相對表達水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與水蛭虻蟲組比較，◇P<0.05；與桃仁大黃組比較，☆P<0.05；與抵當湯組比較，□P<0.05。

表2　抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3相對表達水平影響的兩因素析因設計方差分析

注：A.正常對照組；B.模型組；C.抵當湯組；D.水蛭虻蟲組；E.桃仁大黃組；F.纈沙坦組。

圖1抵當湯及其拆方對ANP、JAK2和STAT3蛋白相對表達的影響(Western blot法)

3.4模型因素對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平的影響與正常對照組相比，模型組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平明顯上調(P<0.05)。見表3。

3.5抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平的影響以模型組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和抵當湯組作為實驗組合進行兩因素析因設計的方差分析，結果顯示水蛭虻蟲拆方對大鼠心肌組織JAK2 mRNA表達水平的主效應具有統計學意義(P<0.05)，對STAT3 mRNA表達水平的主效應無統計學意義(P>0.05)，桃仁大黃拆方對JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平的主效應均具有統計學意義(P<0.05)，兩個拆方的交互作用均具有統計學意義(P<0.05)。見表4。簡單效應分析結果顯示，抵當湯組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平顯著高于桃仁大黃組(P<0.05)，而與水蛭虻蟲組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平的差異無統計學意義(P>0.05)。

3.6抵當湯及其拆方和纈沙坦對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA和STAT3 mRNA相對表達水平的影響以水蛭虻蟲組、桃仁大黃組、抵當湯組和纈沙坦組為實驗組合進行單因素方差分析，結果顯示4組糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA表達水平比較，差異具有統計學意義(F(3，8)=48.31，P=0.000)；4組STAT3 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(F(3，8)=3.91，P=0.055)。多重比較發現，纈沙坦組JAK2 mRNA表達水平顯著低于抵當湯及其拆方組(P<0.05)。見表3。

4討論

本研究觀察了具有化瘀瀉熱通絡作用的《傷寒論》經方抵當湯及其2組拆方——具有化瘀瀉熱作用的桃仁大黃配伍和具有逐瘀通絡作用的虻蟲水蛭配伍對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的干預作用。

表3　各組大鼠JAK2 mRNA和STAT3

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與水蛭虻蟲組比較，◇P<0.05；與桃仁大黃組比較，☆P<0.05；與抵當湯組比較，□P<0.05。

ANP是一種由心臟合成、貯存和分泌的活性多肽類激素，其代償性升高，被公認為心肌細胞肥大的特征性指標之一[9]，可作為早期診斷DCM的一項參考指標[10]。Oh YB等[11]研究發現，Ang Ⅱ通過血管緊張素1型受體(receptor, angiotensin, type 1, AT1)抑制內源性ANP的分泌。Luchner等[12]研究發現，心肌細胞肥大發生發展過程中，伴隨ANP不斷升高，然而當心肌細胞肥大受到抑制后，ANP水平亦會相應降低。纈沙坦作為Ang Ⅱ受體拮抗劑，通過阻斷Ang Ⅱ與其受體AT1結合來延緩心肌細胞肥大[13]。本研究中模型組和正常對照組相比，大鼠心肌細胞ANP表達顯著上調，說明糖尿病時出現心肌細胞肥大的表現，而治療組ANP下調，說明抵當湯可以預防心肌細胞肥大的發生，與纈沙坦的作用相當，但全方的作用優于逐瘀通絡水蛭虻蟲配伍和化瘀瀉熱桃仁大黃配伍。

JAK/STAT信號通路包括JAKs家族和STATs家族，JAKs是一種酪氨酸蛋白激酶，STATs家族是其下游信號分子。當細胞外信號分子與膜受體結合后，激活胞內偶聯的JAKs激酶，激活后的JAKs又能夠磷酸化受體上的酪氨酸位點，使受體產生與STATs結合的區域，從而使STATs磷酸化，形成二聚體，從而將信號由細胞膜向核內傳遞[14]。研究[15]發現,JAK2、STAT3表達異常在心肌細胞肥大的發病機制中扮演重要角色，具有活血祛瘀的中藥能通過抑制JAK2、STAT3的表達防治心肌細胞肥大。本研究顯示，抵當湯組和纈沙坦組下調JAK2和STAT3 mRNA及其蛋白的表達，抑制JAK/STAT信號通路，對糖尿病心肌細胞肥大有干預作用；拆方組作用同樣弱于全方組和纈沙坦組。

綜上，具有化瘀瀉熱通絡作用的抵當湯抑制心肌細胞肥大與調控JAK/STAT信號通路，下調ANP的表達密切相關，且化瘀瀉熱通絡的抵當湯作用優于僅具有逐瘀通絡的水蛭虻蟲配伍和化瘀瀉熱的桃仁大黃配伍。說明經方的配伍組成有其合理性，對糖尿病心肌細胞肥大的抑制作用來看，化瘀瀉熱通絡作用綜合起來較之單一作用為優。

參考文獻：

[1]Battiprolu PK1，Hojayev B，Jiang N，et al.Metabolic stress-induced activation of FoxO1 triggers diabetic cardiomyopathy in mice[J].J Clin Invest，2012，122(3):1109-1118.

[2]Mehta PK，Griendling KK.Angiotensin Ⅱ cell signaling: physiological and pathological effects in the cardiovascular system[J].Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(1):C82-C97.

[3]Booz GW，Day JNE，Baker KM.Interplay between the cardiac renin angiotensin system and JAK-STAT signaling: role in cardiac hypertrophy，ischemia/reperfusion dysfunction and heart failure[J].J Mol Cell Cardiol，2002，34(11):1443-1453．

[4]田佳星，趙林華，周強，等.抵當湯加減治療糖尿病腎病微量蛋白尿的回顧性分析[J].北京中醫藥大學學報(中醫臨床版)，2012，19(6):7-10.

[5]李春深，常柏，苗戎，等.抵當湯早期干預對糖尿病大鼠視網膜ICAM-1和VCAM-1表達的影響[J].北京中醫藥，2013，32(2):129-134.

[6]金末淑.仝小林應用抵當湯加減治療糖尿病腎病驗案舉隅[J].山東中醫藥大學學報，2012，36(2):130-131.

[7]張凱，儲全根，劉新萍，等.抵當湯及其拆方對糖尿病心肌病變的影響[J].中醫雜志，2015，56(13):1136-1139.

[8]劉新萍，張凱，儲全根，等.不同劑量鏈脲佐菌素腹腔注射制備大鼠糖尿病心肌病模型的病理學觀察[J].生物學雜志，2013，30(6):14-17.

[9]Silberbach M，Roberts CT Jr.Natriuretic peptide signalling:molecular and cellular pathways to growth regulation[J].Cell Signal，2001，13(4):221-231.

[10]錢方方，李堅，李連喜，等.血清心鈉素測定與診斷糖尿病心肌病可行性的研究[J].浙江大學學報(醫學版)，2007，17(4):329-331.

[11]Oh YB，Gao S，Shah A，et al. Endogenous angiotensin Ⅱ suppresses stretch-induced ANP secretion via AT1 receptor pathway[J].Peptides，2011，32(2):374-381.

[12]Luchner A，Muders F，Dietlo，et al. Differential expression of cardiac ANP and BNP in a rabbit model of progressive left ventricular dysfunction[J].Cardiovas Res，2001，51(3):601-607.

[13]Chen G，Pan SQ，Shen C，et al. Puerarin inhibits angiotensin Ⅱ-induced cardiac hypertrophy via the redox-sensitive ERK1/2，p38 and NF-κB pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2014，35(4):463-475.

[14]Yang L，Lian X，Cowen A，et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor alpha in regulation of the surfactant protein B gene in the lung[J].Mol Endocrinol，2004，18(6):1520.

[15]張麗，高美華.川穹嗪對大鼠心肌肥大JAK-STAT通路作用[J].青島大學醫學院學報，2009，45(6):505-510.

Effect of Didang Decoction on Myocardial JAK2/STAT3 Pathway in Diabetic Rats

ZHANGKai,CHUQuan-gen,BIHua-jian,LIUXin-ping,WUYuan-jie,ZHOUXue-mei,LIUDe-sheng,DONGYan-yan

(AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Didang Decoction and its separated recipes on the JAK2/STAT3 pathway in hypertrophic cardiomyocytes in diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was established with a single injection of streptozotocin (STZ). The diabetic rats were randomly divided into model group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, leech-gadfly group, and valsartan group, and normal male Sprague-Dawley rats were used as normal control group. The rats in the normal control group and model group were given distilled water by gavage, and those in the other groups were given corresponding drugs by gavage for 8 weeks continuously. Western blot was used to measure atrial natriuretic peptide (ANP) level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium, and quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of JAK2 and STAT3.ResultsCompared with the normal control group, the model group showed significantly upregulated ANP level and protein and mRNA expression of JAK2 and STAT3 (P<0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed significant main effects on ANP level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05), but the interaction between the two recipes was not significant (P>0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed a significant interaction in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05). The ANP level and the mRNA and protein expression of JAK2 showed significant differences between the valsartan group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, and leech-gadfly group (P<0.05).ConclusionThe mechanism of action of Didang Decoction in delaying cardiomyocyte hypertrophy in diabetic rats may be related to its inhibitory effect on the JAK2/STAT3 pathway, and the separated recipes of Didang Decoction interact with each other in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3.

[Key words]Diabetes; Cardiomyocyte hypertrophy; Didang Decoction; JAK/STAT pathway

(收稿日期：2015-09-11；編輯：曹健)

[中圖分類號]R587.1；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.022

通信作者：儲全根，chuquangen@sohu.com

作者簡介：張凱(1979-)，碩士，講師

基金項目：國家自然科學基金項目(81273645)；安徽省自然科學基金項目(1408085MKL32)