解毒消癥飲治療胃癌機制的計算機篩選研究

王　君，楊雪梅，陳梅妹，陳立武

(1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院普外科，福建 福州　350003；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州　350122)

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解毒消癥飲治療胃癌機制的計算機篩選研究

王君1，楊雪梅2，陳梅妹2，陳立武1

(1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院普外科，福建 福州350003；2.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州350122)

[摘要]目的采用計算機虛擬篩選技術探討解毒消癥飲治療胃癌的作用機制。方法先采用分子描述符計算和主成分分析法研究解毒消癥飲中148個化合物與32個抗腫瘤藥物的化學空間信息分布，探討其類藥性質；再通過分子對接方法研究解毒消癥飲和腫瘤相關受體靶標如人表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和環氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的相互作用情況，以探討其治療胃癌的分子機制。結果解毒消癥飲所含分子與抗腫瘤藥物有類藥性，且更具多樣性；解毒消癥飲中91個化合物與EGFR、HER-2和COX-2有著顯著的活性抑制作用。結論解毒消癥飲治療胃癌的作用機制可能涉及到抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及促細胞凋亡等方面，與胃癌發病機制相符合。

[關鍵詞]解毒消癥飲；胃癌；分子描述符；分子對接

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。近年來，胃癌的發病率和病死率已顯著下降[1]，但仍舊是全球第四大常見腫瘤，居腫瘤相關死亡病因的第二位[2]。中國是胃癌的高發區，年患病率和病死率居高不下，均是世界平均水平的2倍多[3]。人表皮生長因子受體家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和環氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)被認為與人類腫瘤密切相關，是胃癌靶向治療的不同靶點基因。

EGFR和HER-2都屬于Ⅰ型酪氨酸激酶受體基因家族，受體的蛋白結構由細胞外配體結合區、跨膜區及胞內酪氨酸激酶區組成[4]。EGFR與配體結合后引起受體二聚化及胞漿內酪氨酸激酶區自身磷酸化并激活酪氨酸激酶的活性，進而激活下游的信號通路，如膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳遞途徑(retrovirus-associated DNA sequences-rapidly accelerated fibrosarcoma-mitogen activated protein kinase，Ras-Raf-MAPK)、酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄活化因子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)、磷酯酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphatidyli nositol 3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt)等，參與腫瘤細胞增殖、血管生成、侵襲、轉移及凋亡抑制等基因調控，在多種腫瘤組織中有高表達。EGFR在進展期胃癌中高度表達，常伴有EGFR相關蛋白的表達下調，提示患者預后很差[5]。HER-2與EGFR結構相似，有很高的同源序列。在正常情況下處于非激活狀態，當受到體內外某些因素作用后，其結構或表達調控失常從而被激活，具有腫瘤轉化活性，最終從多個途徑影響腫瘤細胞的生物活動，如細胞增殖、黏附、轉移和分化等，導致腫瘤的復發和轉移[6]。在人類許多上皮源性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中發現存在有HER-2癌基因的擴增及其癌基因蛋白的過表達，而且HER-2亦參與腫瘤的形成。HER-2在NCI-N87和4-1ST等胃癌細胞系中常高表達。HER-2過度表達的惡性腫瘤具有更強的侵襲、轉移能力，預后較差[4,7]。

COX是花生四烯酸代謝的關鍵限速酶，目前已發現至少有COX-1和COX-2兩種亞型。近年來,大量研究結果表明,COX-2過度表達與消化系統腫瘤的發生和發展密切相關[8-9]。COX-2的高表達能夠促進細胞黏附，抑制細胞凋亡、促進腫瘤生長加速和侵襲轉移，預后變差[10]。

中醫藥在胃癌的治療中發揮著獨特作用，目前許多研究證實中西醫結合治療胃癌可以取長補短，提高遠期療效。解毒消癥飲是福建中醫藥大學附屬第二人民醫院用于消化系統腫瘤圍手術期治療的臨床驗方,主要由白花蛇舌草、苦參、夏枯草和山慈姑四味中藥組成(根據最新臨床研究結果，去掉原方中鬼針草，新增夏枯草)，該方被臨床證明具有減少復發、延長患者生存期、提高患者生活質量的功效[11]。考慮到復方制劑成分復雜，抑制腫瘤生長的途徑是多方面的，各種具體有效成分尚未明確，本研究將通過計算機藥物虛擬篩選技術中分子對接方法來探討解毒消癥飲治療胃癌的作用機制，為指導臨床用藥奠定分子生物學基礎。

1材料與方法

1.1分子化合物的收集和結構優化根據解毒消癥飲中藥組成從《Beilstein/Gmelin CrossFire化學數據庫》《北京大學中草藥數據庫》《中華本草》《中藥原植物化學成分手冊》等國內外文獻收集中藥化學成分，經過分子結構校對和排重，得到復方所含化合物148個。在分子計算軟件Discovery Studio 2.0(DS 2.0)的Standalone模塊搭建分子結構，并用Ligand Minimization模塊，選用默克分子力場(merck molecular force field，MMFF)進行分子三維結構優化。軟件運行環境為DS 2.0圖形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系統。

此外，根據當前抗腫瘤藥物類型收集32個抗腫瘤藥物，主要涉及烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、鉑類配合物和激素大類，用于分析解毒消癥飲中化合物的抗腫瘤類藥性，并按上述方法進行三維結構優化。

1.2分子描述符的計算分子描述符是連接分子結構和化合物活性的紐帶，是表征化學結構變化的參數，可以揭示分子的空間信息[12]。因此，本研究選取了19個比較常用的分子描述符進行計算，其中結構描述符包括分子量(molecular weight，MW)、可旋轉化學鍵數(rotational chemical bond number，nRB)、環個數(ring number，nR)、芳環個數(aromatic ring number，nAR)、氫鍵受體數(hydrogen bond receptor number，nHAcc)、氫鍵給體數(hydrogen bond donor number，nHDon)，空間描述符包括分子體積(molecular volume，Vm)、分子表面面積(molecular surface area，SA)、極性表面面積(polar surface area，PSA)、極性表面積分率(fractional polar surface area，FPSA)，拓撲描述符包括Wiener指標、Zagreb指標、Kappa形狀指標(6個)，脂水分配系數為AlogP98[13]。為了從多維數據中提取直觀的信息，本研究運用SPSS 19.0對所計算的19個描述符進行了主成分分析。

1.3分子對接

1.3.1受體晶體結構處理從國際蛋白晶體結構數據庫下載EGFR受體、HER-2受體和COX-2酶的三維結構，代碼分別為3W32、3RCD和3LN1。分子對接前需要進行一定處理，即載入charm力場，在此力場下擬合受體大分子的鍵縮能、鍵角彎折能、二面角扭轉能、范德華相互作用能、靜電相互作用能等經驗參數，然后去除水分子環境，加上極性氫原子并賦予電荷。

1.3.2分子對接計算分子對接采用DS 2.0中的LigandFit模塊，以蛋白質的原配體分子所在位置為結合位點，半徑為0.5 nm內的所有氨基殘基作為結合位點的活性口袋。計算蛋白配體相互作用能，采用Dreiding力場打分，柔性對接，使用蒙特卡羅方法進行構象采樣，采樣步長為15 000步，只保留得分最高構象。其余參數使用LigandFit中的缺省值。

1.3.3對接結果評價LigandFit默認采用LigScore1、LigScore2、PLP1、PLP2等打分函數來綜合評價分子之間相互作用的幾何形狀匹配、能量匹配及化學環境匹配。Dockscore是對接結果的衡量指標，因此，以原配體的Dockscore值及實驗值為標準，篩選復方有效抑制成分。

1.3.4運行軟件應用Accelrys公司的DS 2.0軟件。軟件運行環境：DS 2.0 圖形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系統。本研究在北京大學中藥現代化研究中心計算機模擬實驗室完成。

2結果

2.1解毒消癥飲中分子化合物的化學空間信息分析解毒消癥飲中化合物常用分子描述符的統計值見表1，其中，MW、nHDon、nHAcc和ALogP98的平均值和中位數均符合口服藥的五大規則[10]，即MW小于500，nHDon小于5，nHAcc小于10，ALogP98小于5。因此，解毒消癥飲中大部分化合物具有較好的類藥性質。圖1為解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的主成分分析示意圖，3個主成分PC1、PC2和PC3，基本包含了全部指標具有的信息，累計貢獻率分別達到96%和83%，特征值都大于1。解毒消癥飲中化合物在圖中分布較廣，說明其含有的化合物結構具有多樣性，體現了中藥復方化學成分多樣性。另外，圖1中解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物在化學空間分布有較大的重疊，說明二者化合物結構具有較大的相似性，又保持各自的特點。

2.2解毒消癥飲中化合物與靶標相互作用分析根據靶標晶體復合物中配體與靶標蛋白Dockscore值大小，以100為解毒消癥飲中抗腫瘤顯著活性成分的閾值，共篩選出91個顯著活性化合物，約占復方化合物總數的70%(見表2)。這些活性成分主要來自苦參、白花蛇舌草和夏枯草3味中藥。表2中靶標名稱顯示，苦參、白花蛇舌草分別含有能與3個靶標(EGFR，HER-2和COX-2)有顯著活性作用的化合物，而夏枯草含有與EGFR和HER-2有顯著活性作用化合物，說明3味中藥之間相互協同以增強藥效。從活性化合物個數可以得出，苦參是復方中含有活性成分最多的中藥，說明苦參在該復方中的重要位置。表2的靶標功能顯示，解毒消癥飲的作用機制可能涉及到抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及促細胞凋亡等方面。其中，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移作用主要是通過抑制EGFR和HER-2來調控腫瘤細胞分化進程。抑制腫瘤細胞增殖、促細胞凋亡作用主要是通過抑制COX-2來調控腫瘤細胞的代謝。

表1　解毒消癥飲中化合物常用分子描述符的

注：綠色方形表示解毒消癥飲中化合物，紅色圓形表示抗腫瘤藥物。

圖1解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的

主成分分析示意圖

3討論

解毒消癥飲中化合物分子描述符的統計值，表明解毒消癥飲中大部分化合物具有較好的口服吸收類藥性質。解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的主成分分析示意圖表明解毒消癥飲不僅含有抗腫瘤活性化合物，同時還含有其他生理活性的化合物。解毒消癥飲虛擬篩選結果顯示，91個顯著活性化合物主要來自苦參、白花蛇舌草和夏枯草3味中藥。苦參是臨床上常用的抗癌解毒中藥，具有抑制腫瘤細胞生長，保護機體免疫等作用。白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗化學誘變、抗氧化、抗菌及免疫調節作用，臨床主要用于治療腫瘤和炎性反應疾病。夏枯草具有直接抑制腫瘤生長與增殖作用，誘導腫瘤細胞凋亡，調節機體免疫等作用，是一種常用抗腫瘤中藥。可見，分子對接計算結果與3味中藥的藥效基本一致。解毒消癥飲與EGFR，HER-2和COX-2都有相互作用，體現了中藥多靶點、多種途徑、多層次地作用于腫瘤細胞。同時，通過對解毒消癥飲相互作用的靶標(EGFR，HER-2和COX-2)功能分析，可以推測解毒消癥飲抗腫瘤作用是通過多種機制協同抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及促細胞凋亡作用而實現的，這與惡性腫瘤的發病機制相一致。

表2　解毒消癥飲靶標的虛擬篩選結果

結果表明，解毒消癥飲是通過抑制EGFR，HER-2和COX-2多靶標協同抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及促細胞凋亡作用而實現抗腫瘤作用，證實胃癌與EGFR，HER-2和COX-2密切關系，同時也揭示白花蛇舌草、苦參和夏枯草3味中藥在復方中抗腫瘤的重要作用，可有效地防止腫瘤的生長和轉移。

(衷心感謝北京大學徐筱杰教授課題組提供的技術支持與幫助！)

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A Computer-based Virtual Screening Study of Therapeutic Mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction in Treatment of Gastric Cancer

WANGJun1,YANGXue-mei2,CHENMei-mei2,CHENLi-wu1

(1.TheSecondPeople’sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350003,China; 2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350122,China)

[Abstract]Objective To explore the therapeutic mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction (JDXZD) in the treatment of gastric cancer using the computer-based virtual screening method. MethodsThe calculation of molecular descriptors and analysis of principal components were used to study the distribution of information on 148 compounds in JDXZD and 32 anticancer drugs in chemical space, and to evaluate the drug-likeness of the compounds in JDXZD. Molecular docking was used to study the interactions between the compounds in JDXZD and tumor-related receptors such as epidermal growth factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2), and cyclooxygenase-2 (COX-2), and to explore the molecular mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer. ResultsThe compounds in JDXZD resembled the anticancer drugs and had a higher diversity than the anticancer drugs. Ninety-one compounds in JDXZD exhibited substantial inhibitory effects on EGFR, HER-2, and COX-2. ConclusionThe therapeutic mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer might be associated with inhibition of proliferation, invasion, and metastasis of tumor cells and promotion of apoptosis, which is in accord with the pathogenesis of gastric cancer.

[Key words]Jiedu Xiaozheng Decoction; Gastric cancer; Molecular descriptor; Molecular docking

(收稿日期：2015-09-06；編輯：姚實林)

[中圖分類號]R735.2；R285.5

[文獻標志碼]A[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.021

通信作者：陳立武，945162540@qq.com

作者簡介：王君(1976-)，男，碩士，主治醫師

基金項目：福建省中醫藥科技項目(wzrk201303)；國家自然科學基金項目(81202646，81503497)；福建省自然科學基金面上項目(2015J01340)