超高壓提取女貞子總三萜工藝條件的優化

王雪竹,吳順紅,趙光遠

(1.河南省食品藥品審評查驗中心;2.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州　450000)

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超高壓提取女貞子總三萜工藝條件的優化

王雪竹1,吳順紅2,趙光遠2

(1.河南省食品藥品審評查驗中心;2.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州450000)

摘要：目的優化超高壓提取女貞子總三萜的工藝條件，并且同回流提取和超聲提取方法進行比較。方法以女貞子為原料, 總三萜得率為指標，采用單因素試驗和正交試驗，從粉碎度、超高壓壓力、時間、固液比(g∶mL)四個方面對提取的工藝條件進行優化。結果最佳工藝條件為：粉碎度60目、壓力400 MPa、 提取4 min、 固液比1∶15。在最佳的條件下，總三萜的得率為6.08%，回流提取和超聲提取的得率分別為5.82%和5.68%。結論超高壓提取方法較回流提取和超聲提取的得率高，且提取時間短，是女貞子總三萜提取的適宜方法。

關鍵詞：女貞子；總三萜；超高壓提取；工藝優化

女貞子為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的干燥成熟果實[1]。女貞子中含有三萜類、黃酮類、多糖類、醚萜類等多種活性成分[2-5]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫調節和抗腫瘤等功能作用[6-9]。三萜類化合物是女貞子中主要的活性成分[10-12]。因此，提取女貞子中三萜成分對開發利用女貞子具有重要意義。

潘晴等[13]用80%的乙醇回流，石油醚萃取從石油醚部分中鑒定了齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、19α-羥基-3-乙酰烏索酸三個成分；張靜等[14]采用超聲提取的方法，通過單因素試驗和正交試驗考察了超聲提取對女貞子三萜類化合物的影響。但微波提取和超聲提取易造成部分成分的破壞。近年來，超高壓提取方法在天然產物的功能成分提取上得到應用，其提取時間短、提取得率高[15-18]。但采用超高壓提取女貞子總三萜，目前還少見報道。正交實驗法是天然產物提取工藝中較好的工藝優化方法[19-20]，本研究擬采用超高壓提取女貞子總三萜，對其提取工藝進行正交實驗優化，并且同回流提取和超聲提取方法進行比較，以期為女貞子資源的利用提供理論支撐。

1材料

女貞子于2015年12月采自鄭州，由鄭州輕工業學院縱偉教授鑒定為木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit. )，干燥粉碎后備用；UHP900×2-Z超高壓處理裝置，購自包頭科發公司；R-205 型旋轉蒸發儀，購自上海申勝生物技術有限公司。乙醇、乙酸乙酯等為分析純。

2方法與結果

2.1女貞子總三萜超高壓提取 女貞子粉碎后加入一定量的無水乙醇，混勻后裝入聚乙烯塑料袋，雙層封口后放入超高壓容積腔中，超高壓處理一定時間后取出，剪開塑料袋，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得女貞子總三萜粗提取物，然后測定其中的總三萜含量，計算其中女貞子總三萜質量。按下式計算女貞子總三萜的得率。

女貞子總三萜的得率(%)=女貞子總三萜/女貞子質量×100%

2.2總三萜含量的測定采用薄層色譜分離—紫外分光光度法測定女貞子總三萜含量。首先配制 1.00 g·L-1的熊果酸標準品甲醇溶液，依次量取0、20、40、60、80、100 μL的熊果酸甲醇溶液，在將經活化的0.5%(w/v)羧甲基纖維素鈉—硅膠G薄板分成左右二個區域，在其中一個區域上點樣，同時在另外一個區域點上相同的溶液作為對照，然后在層析缸中以甲醇∶氯仿=3∶1為展開劑展開，展開后揮干溶劑，在對照樣的相應的部分噴10%(v/v)硫酸乙醇，然后放在烘箱中，以105℃顯色10 min，對照樣顯色后刮取于紅紫色部分相對應的樣品樣部分的相應條帶，以甲醇為溶劑進行浸泡2 h ,5 000 r·min-1離心15 min后收集上清，85℃水浴蒸干甲醇，然后加0.3 mL的5%(w/v)香草醛冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，在60℃下反應15 min,然后冰水冷卻，加5 mL冰醋酸，在542 nm測定反應液的吸光度，繪制吸光度和三萜含量的標準曲線(圖1)。該標準曲線線性方程為：Y=0.004 3X+0.005，其中X為含量(μg)，Y為吸光度，R2=0.999。

圖1　三萜化合物標準曲線

2.3超高壓提取單因素試驗選擇粉碎度、超高壓壓力、保壓時間、固液比(g∶mL)四個因素進行單因素試驗，在固定三個因素水平的前提條件下，對剩余一個影響因素進行單因素研究，其固定條件為：粉碎度60目、壓力400 MPa、時間4 min、固液比1∶15(g∶mL)。

2.3.1粉碎度對總三萜得率的影響在超高壓壓力400 MPa、保壓時間4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，對不同粉碎度的女貞子進行提取，粉碎度對得率的影響如圖2所示。

圖2　粉碎度對總三萜得率的影響

在60目前，總三萜得率隨粉碎度的增加而增加，但達到60目后，繼續增加粉碎程度，得率略有下降。這是因為粉碎度達到一定程度后，繼續粉碎，細胞過度破壞，導致大量雜質溶出，影響總三萜溶出。因此，60目粉碎度較適宜。

2.3.2壓力對總三萜得率的影響在60目粉碎度、超高壓保壓時間4 min、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，不同超高壓壓力對總三萜得率的影響如圖3所示。

如圖3所示，400 MPa前，總三萜得率隨壓力的增加而增加，壓力高于400 MPa后，總三萜得率隨壓力增加而略下降。這是因為超高壓下，細胞發生形變導致破壞，促進細胞內的有效成分溶出。但壓力過大，細胞過度破壞，導致大量雜質溶出，影響總三萜溶出。因此，壓力選擇400 MPa為宜。

圖3　超高壓壓力對總三萜得率的影響

2.3.3保壓時間對總三萜得率的影響在60目粉碎度、400 MPa、固液比1∶15 (g∶mL)的條件下，不同處理時間對總三萜得率的影響如圖4所示。

如圖4所示，4 min前, 總三萜得率隨時間增加而增加，超過4 min后，得率變化較小。這是因為4 min時，已造成女貞子細胞的破壞，繼續增加時間，細胞過度破壞，導致大量雜質溶出，影響總三萜溶出。因此，保壓時間選擇4 min。

圖4　保壓時間對總三萜得率的影響

2.3.4固液比對總三萜得率的影響在60目粉碎度、400 MPa、保壓時間4 min的條件下，不同固液比對總三萜得率的影響如圖5所示。

圖5　固液比對總三萜得率的影響

如圖5所示，1∶15 (g∶mL)前, 總三萜得率隨溶劑用量增加而增加，超過1∶15后，得率增加緩慢。這是因為溶劑用量大，女貞子細胞壁內外兩側的三萜化合物濃度差大，有利于其擴散和溶出，但過大的固液比在實際使用中會導致后續的濃縮工序負擔較大，因此，固液比選擇1∶15。

2.4正交實驗優化在單因素的基礎上，采用L9(34)正交實驗對女貞子三萜的提取工藝進行優化，實驗因素與水平表見表1。正交實驗結果見表2。由極差R分析可知，各因素對女貞子總三萜得率影響的次序為：超高壓壓力>粉碎度>保壓時間>固液比。最佳提取條件為 A2B2C2D2，即：粉碎度60目、壓力400 MPa、時間4 min、固液比1∶15。對表2進行的方差分析結果見表3。從表3可見，粉碎度和超高壓壓力對女貞子總三萜得率在所考察的范圍內影響顯著，保壓時間和固液比對女貞子總三萜得率在所考察的范圍內影響不顯著。

2.5工藝驗證實驗根據正交試驗結果篩選的工藝條件進行3批驗證試驗，以優化工藝作為標準提取總三萜，得率都較高，總三萜得率分別為6.07%、6.08%、6.09%，總三萜得率的平均值為6.08%。試驗結果表明，所優化的提取工藝合理可行，且結果穩定可靠。

2.6三種提取方法的比較參照文獻[13]進行女貞子總三萜回流提取，取已粉碎好的女貞子 (60目)100.0 g，裝入乙醇回流瓶內，加入90%乙醇連續回流120 min，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得回流提取的女貞子總三萜。

參照文獻[20-21]進行女貞子總三萜超聲提取，取已粉碎好的女貞子 (60目)10.0 g，加入100 mL 90%乙醇的乙醇，在提取溫度75℃、液固比1∶15、乙醇體積分數90%超聲功率 480W條件下提取25 min，提取液過濾，真空濃縮，加水混勻后加入乙酸乙酯萃取，萃取液真空濃縮后再干燥至恒重，得超聲提取提取的女貞子總三萜。

三種提取方法的總三萜得率比較見圖6。

表1　因素與水平表

表2　正交實驗結果

表3　方差分析結果

圖6三種提取方法的比較

由圖6可見，回流提取和超聲提取的得率分別是5.82%和5.68%，三種提取方法的時間分別是超高壓提取4 min ,超聲提取25 min，回流提取120 min。超高壓提取方法的得率較回流提取得率高，且提取時間較超聲提取和回流提取時間短。

3討論

超高壓提取總三萜得率高，時間短，是由于植物在超高壓下，細胞快速發生形變，當壓力突然泄除后，細胞內外的壓差變化，導致細胞快速破壞，使得細胞內的三萜成分溶出過程的傳質阻力減小，得率得到提高[22]。但在超高壓下，提供的能量不會破壞共價鍵，因此，三萜成分不會破壞。

在超高壓提取植物有效成分的過程中，粉碎度、超高壓壓力、保壓時間、固液比和溶劑濃度是影響提取得率的主要因素。本實驗得到超高壓提取女貞子總三萜的最佳工藝條件為：粉碎度60目、超高壓壓力400 MPa 、時間4 min和固液比1∶15。在最佳的提取條件下，女貞子總三萜得率可達6.08%，回流提取和超聲提取的得率分別是5.82%和5.68%，三種提取方法的時間分別是超高壓提取4 min ,超聲提取25 min，回流提取120 min,超高壓提取方法的得率較回流提取得率高，且提取時間較超聲提取和回流提取時間短。因此，超高壓提取方法是女貞子總三萜提取的適宜方法。

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Extraction conditions optimization of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi

WANG Xue-zhu1,WU Shun-hong2,ZHAO Guang-yuan2

(1.HenanProvincialFoodandDrugInspectionCenter;2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou,Henan450000,China)

Abstract:Objective To optimize extraction conditions of total triterpenes by ultra high pressure from Fructus Ligustri Lucidi and comparing with reflux extraction and ultrasonic extraction method . Methods Using Fructus Ligustri Lucidi as material and yields of total triterpenes as indexes, extraction conditions such as grinding degree, pressure, time, and the ratio of solid to liquid were optimized by signal factors test and orthogonal test.Conclusions Optimum extraction conditions were as follows: grinding degree 60 mesh, pressure 400 MPa, time 4 min and stock ratio 1∶15 (g∶mL). Under optimum extraction conditions, the yield of total triterpenes was 6.08%.The yield of reflux extraction and ultrasonic extraction were 5.82% and 5.68%, respectively. Conclusions Ultra high pressure extraction method has higher yield than the yield of reflux extraction and ultrasonic extraction method, and has shorter time than reflux extraction and ultrasonic extraction method. So, Ultra high pressure extraction method was a suitable method for total triterpenes extraction from Fructus Ligustri Lucidi.

Key words:Fructus Ligustri Lucidi;total triterpenes;ultra high pressure extraction;technology optimization

(收稿日期：2016-01-18，修回日期：2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.007

基金項目：2015年河南省創新型科技團隊項目(No C20150024)