武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素含量測定研究

李　聰，鄭　芳，朱雪松，周玉濤，郭賢明

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部,武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬第二臨床學(xué)院；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰　442008)

?

武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素含量測定研究

李聰1，鄭芳1，朱雪松1，周玉濤2，郭賢明3

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部,武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬第二臨床學(xué)院；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰442008)

摘要：目的探討武當(dāng)?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法測定松針中原花青素的含量。色譜柱為Sum Fortis C(18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈∶水(15∶85)，流速為0.6 mL·min(-1)，柱溫30℃，檢測波長為280 nm。結(jié)果經(jīng)方法學(xué)考察，原花青素在0.258～2.58 g·L(-1)范圍內(nèi)，峰面積與所試濃度線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度高，精密度好。武當(dāng)?shù)貐^(qū)松針樣品中原花青素含量為44.65 mg·g(-1)。結(jié)論該方法操作簡便，有效成分原花青素的含量較高，開發(fā)前景廣闊，旨在其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：松針；原花青素；高效液相色譜法

松針(Pini Folium)為松科植物華山松(PinusarmandiFranch.)、黃山松(P.TaiwanensisHayata)、馬尾松(P.massonianaLamb)、油松(P.tabulaeformisCarr.)等的干燥針葉[1]。《本草綱目》記載：“松葉，溫，苦，無毒。主治風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)、安五臟、守中、不饑延年”，研究表明，松針富含黃酮類、揮發(fā)油類、維生素、氨基酸及微量元素等成分，其中黃酮類成分前花青素是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的高效抗氧化劑，其抗氧化能力是維生素E的50倍。基于強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力，藥理結(jié)果表明松針黃酮具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、防衰老等作用[2-4]。

目前，《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》“松針”項(xiàng)下載入的松屬植物有馬尾松、油松、云南松，其中對其性狀、鑒別、檢查(總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物等形態(tài)組織及一般定量項(xiàng)目有較詳細(xì)的規(guī)范[1]，但與藥效相關(guān)的主要定量指標(biāo)尚無制訂。故本課題擬初步對松針中原花青素的含量進(jìn)行測定，完善松針質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)，為其進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1儀器與試劑

高效液相色譜儀UltiMate3000(戴安中國有限公司)；色譜柱為Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

松針樣品(批號(hào)：20141101)采自湖北省賽武當(dāng)區(qū)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院陳吉炎教授鑒定為松科松屬植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)。原花青素對照品(北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-12032802)；石油醚(天津化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙醇(武漢市中天化工有限責(zé)任公司)；乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1樣品溶液的制備將所得松針粉用石油醚脫脂，過濾，將濾渣放置在陰涼通風(fēng)處干燥。取樣品5.003 g進(jìn)行超聲提取，提取條件：提取液60%的乙醇50 mL，溫度為45℃，超聲頻率為250 W，提取時(shí)間為50 min，過濾。精密量取濾液1 mL于5 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得[5-7]。

2.2對照品溶液的制備精密稱取原花青素對照品25.8 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為2.58 g·L-1的溶液，精密量取2.5 mL基本溶液搖勻，置于5 mL的容量瓶中制成1.29 g·L-1的對照品溶液，搖勻，備用。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱為Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(15∶85)；流速為0.6 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長為280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下分別取“2.2”項(xiàng)下樣品溶液與“2.3”項(xiàng)下對照品溶液進(jìn)樣，結(jié)果原花青素保留時(shí)間約為3.04 min；理論塔板數(shù)以原花青素峰計(jì)均不低于11 000，原花青素色譜峰的DAD值均不低于999.0，檢測原花青素色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，說明樣品的原花青素與相鄰的色譜峰分離。

2.4流動(dòng)相的選擇經(jīng)查閱文獻(xiàn)[8-11]，調(diào)整流動(dòng)相比例，結(jié)果在乙腈∶水(15∶85)時(shí)，所得色譜峰良好，分離效果明顯，見圖1，2。

圖1　原花青素對照品的HPLC圖

圖2　松針提取液的HPLC圖

2.5方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍考察分別精密量取“2.2”項(xiàng)下原花青素溶液(2.58 g·L-1)1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液。分別取各溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積,分別為5.659、14.705、31.601、46.914、63.287、76.981，以對照品的峰面積(Y)對原花青素對照品的濃度(X)回歸，得回歸方程Y=30.8X-1.204，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，原花青素在0.258～2.58 g·L-1范圍內(nèi)，峰面積與所試濃度線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度試驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下濃度為1.29 g·L-1原花青素對照品溶液，按照含量測定項(xiàng)下的測定方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別為39.764、39.121、39.342、39.554、39.592、39.968，計(jì)算的RSD值為0.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn)稱取松針粉6份，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果分別為28.246、27.179、27.157、26.992、26.641、27.267，原花青素的平均含量為0.882 g·L-1，RSD值為1.99%。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.1”項(xiàng)下松針提取液樣品及“2.2”項(xiàng)下原花青素對照品溶液(1.29 g·L-1)分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，記錄原花青素的峰面積，測得對照品溶液中原花青素峰面積的平均值為39.142，RSD值為1.09%，松針提取液樣品中原花青素面積的平均值為27.135, RSD值為1.29%，表明對照品和樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn)取松針粉末1 g 共6份，分別按照供試品樣品制備方法制備溶液，得到10 mL濾液，取所得濾液0.6 mL于5 mL容量瓶中，加原花青素原液(2.58 g·L-1)1 mL，然后加甲醇稀釋至刻度線，搖勻即得。分別取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并計(jì)算回收率，得平均回收率為97.71%,RSD為2.06%,結(jié)果表明此測定方法回收率良好，見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3松針中原花青素含量的測定

按上述的測定方法及測定條件，對松針樣品中原花青素的含量進(jìn)行測定，平均含量為44.65 mg·g-1。

4討論

4.1波長的選擇在200～400 nm波長范圍內(nèi)，由UltiMate 3000二極管陣列檢測器得原花青素的最大吸收波長為(279.8±0.2) nm，最終將該研究原花青素的檢測波長定為280 nm。

4.2含量測定根據(jù)適宜色譜條件，流動(dòng)相為乙腈∶水(15∶85)，流速為0.6 mL·min-1，柱溫30℃，波長為280 nm，對馬尾松松針樣品中原花青素的含量進(jìn)行測定，平均含量為44.65 mg·g-1，含量較高，加之原花青素具有降血脂、降血糖、抗氧化及增強(qiáng)免疫力等活性，開發(fā)利用前景廣闊[12-13]。

此外，湖北省松林資源豐富，成本低，生物活性極強(qiáng)的黃酮類成分原花青素的優(yōu)勢資源尚未得到利用，本課題將對不同采收期松葉進(jìn)行研究，分析采收期對其影響，為確定松針的適宜采收期，制定較完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)等及其制劑的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]湖北省食品藥品監(jiān)督管理局.湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M].武漢:湖北科技出版社,2009：77.

[2]劉東彥,石曉峰.藥用松針的研究進(jìn)展[J].中藥材,2010,35(10):1701-1705.

[3]孫利民.松針抗衰老作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(2):160-162.

[4]李聰,李鵬,李志浩,等.馬尾松松針的研究概況[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2013,35(8):748-750.

[5]Kim NY,Jang MK,Lee DG,et al.Comparison of methods for proanthocyanidin extraction from pine (Pinus densifloral) needles and biological activities of the extracts[J].Nutr Res Pract,2010,4(1):16-22.

[6]閆琳娜.松針落葉總黃酮的提取、純化及抗氧化性能分析[D].長春：吉林大學(xué)，2009.

[7]張揚(yáng),章建民,馬相鋒,等.不同采集時(shí)間對馬尾松針中主要成分的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(2):516-519.

[8]劉東彥,胡鵬斌,石曉峰,等.HPLC 同時(shí)測定雪松不同部位中4個(gè)黃酮類化合物的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2014,31(12):1510-1514.

[9]曹侃,翁澤斌,顏翠萍,等.皖南地區(qū)常見松針2種黃酮類成分的比較研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(3):280-282.

[10] 嚴(yán)子軍,韋壽蓮,汪洪武,等.HPLC法測定松針中原花青素的含量[J].肇慶學(xué)院學(xué)報(bào),2012,33(5):26-28.

[11] 石曉峰,李師,劉東彥,等.RP-HPLC法同時(shí)測定雪松松針中4個(gè)有效成分的含量[J].藥物分析雜志,2014,34(2):243-246.

[12] 董亦明.松針革命[M].太原:書海出版社,2004:16.

[13] 楊麗華.馬尾松松針抗氧化活性研究及其抗氧化功能飲料研制[D].廣州：廣州醫(yī)科大學(xué),2014.

歡迎訂閱《安徽醫(yī)藥》

《安徽醫(yī)藥》是由安徽省食品藥品監(jiān)督管理局主管，安徽省藥學(xué)會(huì)主辦的綜合性學(xué)術(shù)期刊。本刊是中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊(中國科技核心期刊)、中國核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫期刊、中國學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)源期刊，并被中國期刊網(wǎng)、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版、萬方數(shù)據(jù)庫、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、中文生物醫(yī)學(xué)期刊文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、美國化學(xué)文摘收錄。主要欄目有綜述、藥學(xué)研究、藥物分析、臨床醫(yī)學(xué)、藥物與臨床、醫(yī)院藥學(xué)、藥品監(jiān)督、藥品不良反應(yīng)等。內(nèi)容豐富，編輯規(guī)范，排印精致。讀者對象為全國各地醫(yī)院、藥監(jiān)系統(tǒng)、藥品生產(chǎn)經(jīng)營單位、醫(yī)藥類大專院校、科研機(jī)構(gòu)和有關(guān)單位。

本刊為月刊，大16開，204頁，國內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)CN 34-1229/R,國際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)ISSN 1009-6469。國內(nèi)外公開發(fā)行，郵發(fā)代號(hào)26-175，每期定價(jià)12元，全年144元。歡迎在全國各地郵局訂閱，也可直接到本編輯部訂閱。

地址：安徽省合肥市包河大道與烏魯木齊路交口，安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院內(nèi)技術(shù)檢測樓6樓安徽醫(yī)藥編輯部。郵編：230051，電話：0551-64672615，網(wǎng)址：www.ahyyzz.cn,E-mail：ahyyzz@126.com。

The study on content determination of proanthocyanidins in pine needles in Wudang area

LI Cong,ZHENG Fang,ZHU Xue-song, et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008)

Abstract:Objective To discuss methods for the content determination of proanthocyandins in pine needles in Wudang area. Methods HPLC-DAD was used to determine proanthocyandin content of pine needles. The Column was Sum Fortis C(18 )(4.6 mm×150 mm, 5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-water (15∶85). The flow rate was 0.6 mL·min(-1). The temperature was 30℃, and the detective wavelength was 280 nm.Results The proanthocyandin of pine needles was well separated with other substances. The proanthocyandin’s peak area had a good linear relationship within the concentration range from 0.258 to 2.58 g·L(-1). The results of methodological study demonstrated that the method met the requirements of the determination. The proanthocyandins contents of pine needles were 44.65 mg·g(-1). Conclusions The method was simple and effective contents of procyanidins were high, thus providing basis for its further study with promising prospects.

Key words:pine needles;proanthocyanidins;HPLC

(收稿日期：2015-11-26，修回日期：2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.014

通信作者：朱雪松，男，副教授，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)與臨床藥學(xué)，E-mail：dfpharmacy@163.com

基金項(xiàng)目：湖北省十堰市科技局項(xiàng)目(No 14k73);湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(No 2011JH-2014CXTT15)