靶向survivin基因的小干擾RNA對食管癌細胞Eca-109 化療敏感性的影響

牛朝霞，彭蕤蕤，陳　潔，秦紫芳，裴　瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陳　潔，秦紫芳摘要：目的　利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技術抑制食管癌Eca-109細胞survivin基因表達，觀察survivin基因沉默后對Eca-109細胞化療敏感性的影響。方法　構建靶向survivin基因特定序列的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)真核表達載體并轉染Eca-109細胞，篩選得到穩定轉染的survivin干擾組細胞Eca-109 /si-survivin，同時設轉染無關干擾質粒的Eca-109細胞為陰性對照組，未轉染的Eca-109細胞為空白對照組；通過Western Blot法檢測干擾前后survivin基因沉默抑制效果；隨后將各組細胞與不同濃度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法檢測各組細胞對5-Fu的半數抑制濃度(IC50)，流式細胞儀分析各組細胞的凋亡率。結果　干擾組Eca-109 /si-survivin細胞survivin蛋白表達水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(P<0.05)；聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統計學意義(P<0.05)；聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞凋亡率為(37.35±1.52)%，明顯高于空白對照組(11.26±1.21)%和陰性對照組(12.34±1.32)%，差異具有顯著性(P<0. 05)。 結論　靶向survivin的siRNA能特異性沉默survivin基因表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并增強人食管癌Eca-109細胞對5-Fu的化療敏感性。

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靶向survivin基因的小干擾RNA對食管癌細胞Eca-109 化療敏感性的影響

牛朝霞，彭蕤蕤，陳潔，秦紫芳，裴瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陳潔，秦紫芳摘要：目的利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技術抑制食管癌Eca-109細胞survivin基因表達，觀察survivin基因沉默后對Eca-109細胞化療敏感性的影響。方法構建靶向survivin基因特定序列的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)真核表達載體并轉染Eca-109細胞，篩選得到穩定轉染的survivin干擾組細胞Eca-109 /si-survivin，同時設轉染無關干擾質粒的Eca-109細胞為陰性對照組，未轉染的Eca-109細胞為空白對照組；通過Western Blot法檢測干擾前后survivin基因沉默抑制效果；隨后將各組細胞與不同濃度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法檢測各組細胞對5-Fu的半數抑制濃度(IC50)，流式細胞儀分析各組細胞的凋亡率。結果干擾組Eca-109 /si-survivin細胞survivin蛋白表達水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(P<0.05)；聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統計學意義(P<0.05)；聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞凋亡率為(37.35±1.52)%，明顯高于空白對照組(11.26±1.21)%和陰性對照組(12.34±1.32)%，差異具有顯著性(P<0. 05)。 結論靶向survivin的siRNA能特異性沉默survivin基因表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并增強人食管癌Eca-109細胞對5-Fu的化療敏感性。

關鍵詞：小干擾RNA；survivin基因；Eca-109細胞；化療敏感性

食管癌作為消化系統常見的一種惡性腫瘤，其發病率與病死率在我國呈逐年上升趨勢，是導致中國民眾乃至全世界人群惡性腫瘤死亡的重要因素之一[1-2]。目前臨床絕大多數中晚期食管癌患者主要采取手術輔以放化療的綜合治療手段，大大提高了患者術后5年生存率，改善了預后[3-5]。由此如何有效提高腫瘤對化療藥物的敏感性就成為當前食管癌研究的一個新方向。survivin作為近年來新研究發現的凋亡抑制基因，在包括食管癌在內的人類多數腫瘤組織中呈特異性高表達，而在正常分化的成人組織中表達較低甚至不表達[6]，與腫瘤生長增殖、腫瘤血管生成、腫瘤細胞放化療敏感性等密切相關[7]，已成為當前惡性腫瘤靶向基因治療的熱點基因之一。因此，survivin基因有望成為食管癌患者基因治療的潛在新靶點。本研究利用RNAi技術特異性沉默survivin基因，探討其對食管癌Eca-109細胞化療敏感性的影響，以期為臨床食管癌患者靶向基因治療提供可行性依據。

1材料

1.1主要試劑胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和RPMI1640細胞培養基均購自美國Gibco公司；脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；載體構建相關試劑BamH1/HandⅢ限制性核酸內切酶和T4 DNA連接酶均購自大連寶生物有限公司(TaKaRa公司)；質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；蛋白水平檢測相關試劑BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒大多購自美國Pierce公司；蛋白質分子量標準購自美國Promega公司；Survivin和β-actin檢測相關抗體購自美國Santa Cruz公司；陽性干擾載體pRNAT-U6.1/Neo、陰性對照干擾載體購自美國Gencript公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC試劑盒，購自美國BD公司。

1.2藥品氟尿嘧啶(5-Fu，每支250 mg,批號:1236) 為天津金耀氨基酸有限公司產品。

1.3細胞株人食管癌Eca-109細胞購自上海細胞生物研究所，常規培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，置于含5%CO2、溫度37℃的培養箱內，待細胞生長融合度達70%～80%時，常規以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液進行消化與傳代。

2方法

2.1靶向survivin的寡核苷酸序列的設計利用生物信息學預測軟件，本實驗針對survivin基因487～505 bp的靶點設計兩條互補DNA鏈，其序列分別為：5＇-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGAAGCCACAGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTC-TTTTTTA-3＇和3＇-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTCGGTGTCTACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAG-AAAAAATTCGA-5＇，兩條DNA鏈的結構均為：BamH1酶切點+正義序列+莖環序列+反義序列+轉錄終止子+HindⅢ酶切點，在細胞內形成所謂的“發夾結構”。

2.2真核表達干擾質粒的構建載體pRNAT-U6.1/Neo經HindⅢ和BamH1雙酶切后與已合成的靶向survivin的寡核苷酸鏈退火后連接，即得到針對survivin的siRNA真核表達干擾質粒：pRNAT-siRNA-survivin，同法構建陰性對照質粒：pRNAT-siRNA-control。

2.3細胞穩定轉染待Eca-109細胞達對數生長期即細胞生長融合度達90%左右時，按轉染試劑盒說明將質粒pRNAT-siRNA-survivin和pRNAT-siRNA-control分別轉染Eca-109細胞，待48 h后用G418進行抗性篩選2～3周，可得到穩定的細胞克隆，擴大培養，即為穩定轉染細胞系，分別命名為：Eca-109 /si-survivin干擾組和Eca-109 /si-control陰性對照組，同時設置未轉染的Eca-109為空白對照組細胞。。

2.4Western blot檢測survivin基因沉默效果將對數生長期的survivin干擾組Eca-109 /si-survivin、陰性對照組Eca-109 /si-control、空白對照組Eca-109細胞按蛋白抽提要求進行處理，取各組細胞50μg總蛋白進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，隨后將分離的蛋白質用半干石墨電轉移1.5h至硝酸纖維素膜上，再在室溫搖床上用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)配制的50 g·L-1脫脂奶粉封閉1h，加鼠抗人survivin一抗(1∶300)，4℃搖床孵育過夜，PBS洗膜3次，再加入兔抗鼠二抗(1∶2 000)，室溫孵育1.5 h，再用PBS洗膜3次，最后在化學發光儀上進行顯色，以β-actin作為內參，通過灰度掃描從蛋白表達水平對比觀察干擾前后survivin的不同表達。實驗重復3次。

2.5MTT法分析5-Fu對細胞生長的影響分別取對數生長期的空白對照組細胞Eca-109、陰性對照組細胞Eca-109 /si-control和survivin干擾組細胞Eca-109 /si-survivin每孔0.5×104個接種于96孔板中，每組接種5孔，待培養12 h細胞貼壁后，加5-Fu液，其質量濃度分別為10、25、50、100、200 mg ·L-1，維持每孔終體積200 μL；待細胞培養48 h后每孔加入MTT 20 μL呈色，繼續孵育4 h，終止培養并棄培養液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分溶解；然后在酶標儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度A值。細胞生長抑制率(%)=(對照組A490-實驗組A490)/對照組A490×100%。最后用IC50計算軟件獲取3組細胞的半數抑制濃度(IC50)。

2.6流式細胞術測定細胞凋亡率將加5-Fu液培養48 h處于對數生長期的空白對照組、陰性對照組和survivin干擾組細胞分別收集到試管中，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒要求處理各組細胞，取488 nm為激發波長，用流式細胞儀分別測定各組細胞DNA含量，依DNA含量的分布不同進行細胞凋亡率的分析，每組樣本重復3次。細胞凋亡率即細胞凋亡指數(AI)=陽性凋亡細胞數/觀察細胞總數×100%。

3結果

3.1穩定轉染細胞株的篩選轉染真核表達質粒pRNAT-siRNA-survivin的Eca-109細胞，經不同質量濃度培養液G418抗性篩選，在倒置熒光顯微鏡下形成帶有綠色熒光蛋白GFP的陽性克隆。見圖1。

圖1　穩定轉染pRNAT-siRNA-survivin質粒的

3.2干擾前后survivin蛋白的不同表達以β-actin為內參，灰度掃描結果顯示干擾組Eca-109 /si-survivin細胞survivin蛋白表達水平(18.75±3.12)較陰性對照組Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白對照組Eca-109 (46.20±2.62)明顯下調(P<0.05)；而兩對照組相比survivin蛋白表達無統計學差異((P>0.05)。見圖2。

圖2　Western Blot檢測干擾前后

注：1:Eca-109/si-survivin；2:Eca-109 /si-control；3:Eca-109。

3.35-Fu對三組細胞的生長抑制作用MTT分析顯示：5-Fu對三組細胞的生長抑制作用呈劑量依賴性；對相同質量濃度的5-Fu，干擾組細胞Eca-109 /si-survivin生長抑制率明顯高于空白對照組細胞Eca-109和陰性對照組細胞Eca-109 /si-control，差異具有顯著性(P<0.05)；Eca-109 /si-survivin干擾組細胞5-Fu的IC50為(18.75±1.53)mg·L-1，顯著低于Eca-109空白對照組(39.65±1.75)mg·L-1和Eca-109 /si-control陰性對照組(38.95±1.34)mg·L-1，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　MTT檢測5-Fu對三組細胞的生長抑制作用

3.4沉默survivin基因對5-Fu誘導細胞凋亡的影響分析結果顯示，三組細胞經5-Fu 化療藥物作用后，Eca-109 /si-survivin干擾組平均細胞凋亡率(37.35±1.52)%明顯高于Eca-109 /si-control陰性對照組(12.34±1.32)%和未轉染Eca-109空白對照組(11.26±1.21)%，差異具有顯著性(F=355.459，P<0.05)；而陰性對照組和空白對照組平均細胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)。

4討論

survivin作為近年來新研究發現的抗凋亡基因，具有抑制細胞凋亡的重要生理功能，并參與促進細胞有絲分裂和促進血管的形成[8]。研究表明，survivin基因特異性高表達于人類絕大多數腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中，而在成年分化成熟組織和癌旁組織中低表達甚至不表達[9]，通過抑制腫瘤組織內源性survivin的表達，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長增殖，進而提高癌細胞對放化療的敏感性[10-11]。另有研究證實[12-13]survivin基因在食管癌組織中的表達水平顯著高于鄰近正常食管組織，可能作為一種腫瘤癌基因參與食管癌的發生、發展及轉移等病理生理過程。因此，survivin基因很可能與食管癌的發生、發展及診療密切相關，有望成為食管癌基因治療的理想靶點，從而為食管癌患者臨床綜合治療開辟新的路徑。

RNAi技術是近年來研究哺乳動物細胞基因功能的核心工具，由雙鏈RNA(double strand RNA, dsRNA)介導的特異性抑制同源基因表達的技術，具高度專一性，可產生轉錄后特定基因沉默的效果[14]；目前RNAi技術已廣泛應用于生物工程學、醫學及藥學研究等眾多領域中，為臨床眾多包括食管癌在內的惡性腫瘤患者開辟了靶向基因治療的新路徑。但目前關于抑制survivin基因表達對食管癌化療敏感性影響的研究依然較少。

現今臨床常用于食管癌化療的藥物是氟尿嘧啶或順鉑，本研究通過構建靶向survivin基因的真核表達載體pRNAT-siRNA-survivin，穩定轉染食管癌Eca-109細胞并經化療藥物5-Fu作用后觀察細胞效應的變化。結果顯示，RNA干擾后Eca-109 /si-survivin干擾組細胞survivin蛋白水平的表達明顯低于陰性對照組Eca-109 /si-control和空白對照組Eca-109；與陰性對照組和空白對照組相比，聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞IC50顯著降低，而聯合應用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干擾組細胞凋亡率顯著增加，提示靶向survivin基因的siRNA和5-Fu具有協同效應，能夠大大改善食管癌細胞Eca-109對化療藥物5-Fu的敏感性，其可能機制是促進癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖。因此，本研究主要借助siRNA特異性抑制survivin基因表達為臨床食管癌患者的靶向基因治療和有效化療提供理論基礎。

參考文獻：

[1]Umar SB,Fleischer DE.Esophageal cancer: epidemiology, pathogenesis and prevention[J].Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol,2008,5(9):517-526.

[2]陳萬青,張思維,曾紅梅,等.中國2010年惡性腫瘤發病與死亡[J].中國腫瘤,2014,23(1):1-10.

[3]劉楊,王昆侖,袁翎.151例食管癌調強放療療效及預后影響因素分析[J].中華實用診斷與治療雜志,2015,29(8):791-793.

[4]馮永,胡美云,朱衛國,等.術前誘導化療序貫同步放化療治療局部晚期食管癌[J].南京醫科大學學報(自然科學版),2015,35(9): 1230-1234.

[5]李孝鵬,梁山,白光平,等.43例食管鱗癌累及野放療聯合化療的療效分析[J].安徽醫藥,2015,19(10): 1984-1986.

[6]Altieri DC.Survivin,cancer networks and pathway-directed drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2008,8(1):61-70.

[7]馬福超,馬亦龍.Survivin與腫瘤治療的研究進展[J].中國癌癥防治雜志,2010,2(3):239-241.

[8]曲貝貝,左金華.凋亡抑制基因Survivin的研究進展[J/CD].中華臨床醫師雜志(電子版),2014,8(15):2842-2846.

[9]Yang L,Zhu H,Liu D,et al.Aspirin suppresses growth of human gastric carcinoma cell by inhibiting survivin expression[J].J Biomed Res,2011,25(4):246-253.

[10] 陶紅芳,徐之良,江毅,等.小分子干擾技術緘默Survivin基因表達對Jurkat細胞凋亡和化療敏感性的影響[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(15):1147-1150.

[11] 肖超,雷煒,張碧媛,等.RNA干擾Survivin基因表達對肝癌細胞放射敏感性影響[J].齊魯醫學雜志,2013,28(1):5-7,10.

[12] 李春光,李志剛,陳和忠,等.食管癌診斷治療的重要靶標Survivin [J].診斷學理論與實踐,2011,10(6):571-574.

[13] Bongiovanni L,D'Andrea A,Romanucci M,et al.Epithelial-to-mesenchymal transition: immunohistochemical investigation of related molecules in canine cutaneous epithelial tumours[J].Vet Dermatol,2013,24(1):195-203.

[14] Zhang Y,Fang L,Zhang Q,et al.An oncolytic adenovirus regulated by a radiation-inducible promoter selectively mediates hSulf-1 gene expression and mutually reinforces antitumor activity of I131-metuximab in hepatocellular carcinoma[J].Mol Oncol,2013,7(3):346-358.

Effects of siRNA targeting survivin gene on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109

NIU Zhao-xia, PENG Rui-rui, CHEN Jie, et al

(DepartmentofPathophysiology,HenanMedicalCollege,Zhengzhou,Henan451191,China)

Abstract:Objective To inhibit survivin gene expression by RNA interference technology and investigate the effects on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109. Methods siRNA eukaryotic expressing vector targeting specific sequence of survivin gene was constructed to transfect Eca-109 cells which were screened to select the survivin interference group Eca-109 /si-survivin with stable transfection.Meanwhile, the Eca-109 cells transfected with non-sense sequence were used as the negative control group and those untransfected were used as the blank control group.The expression level of survivin protein was detected by western blot to observe the interference effect. Then the cells of each group were treated with different concentrations of fluorouracil (5-Fu) , IC(50 )of 5-Fu in each group was detected by MTT and cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry. Results The survivin protein level (18.75±3.12) of the interference group Eca-109 /si-survivin was effectively lower than that of the negative control group Eca-109 /si-control (44.17±3.15)and the blank control group Eca-109 (46.20±2.62) (P<0.05); IC(50) of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(18.75±1.53)mg·L(-1) , which was markedly lower than that of the blank control group(39.65±1.75)mg·L(-1) and the negative control group(38.95±1.34)mg·L(-1) with a statistically significant difference (P<0.05). The cell apoptosis rate of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(37.35±1.52)%, which was evidently higher than that of the blank control group(11.26±1.21)% and the negative control group(12.34±1.32)% with a statistically significant difference (P<0.05). Conclusions siRNA targeting survivin can specifically silence the expression of survivin gene, inhibit cell proliferation, induce cell apoptosis, and thus enhance the chemosensitivity of human esophageal cancer Eca-109 cells to 5-Fu.

Key words:small interference RNA;survivin gene;Eca-109 cell;chemosensitivity

(收稿日期：2016-01-15，修回日期：2016-02-13)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.018

基金項目：河南省教育廳科學技術研究重點項目(No 14B310002)