胰島素受體底物-2的Gly1057Asp基因多態性與頸動脈粥樣硬化性狹窄相關性的研究

張萌　鐘池　付文玉　王洪海　許曉偉　劉涵瑜

261000　山東省濰坊醫學院附屬濰坊市人民醫院神經內科[張萌　鐘池(通信作者)　王洪海　許曉偉　劉涵瑜]；濰坊醫學院組織與胚胎教研室(付文玉)

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胰島素受體底物-2的Gly1057Asp基因多態性與頸動脈粥樣硬化性狹窄相關性的研究

張萌鐘池付文玉王洪海許曉偉劉涵瑜

261000山東省濰坊醫學院附屬濰坊市人民醫院神經內科[張萌鐘池(通信作者)王洪海許曉偉劉涵瑜]；濰坊醫學院組織與胚胎教研室(付文玉)

【摘要】目的探討胰島素受體底物-2的Gly1057Asp基因多態性與頸動脈粥樣硬化性狹窄的相關性。方法選擇96例行頸部血管彩超示頸動脈狹窄≥50%的北方漢族人為實驗組以及同期79例體檢健康者作為對照組，通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)技術檢測所有入選患者的Gly1057Asp基因多態性，比較2組的等位基因頻率、基因型頻率以及Gly1057Asp基因多態性對頸動脈狹窄的影響。結果實驗組中G等位基因頻率(78.6%)明顯高于對照組(68.4%)(P<0.05)；實驗組中G/A+A/A基因型頻率(36.5%)明顯低于對照組(51.9%)(P<0.05)。攜帶等位基因G的個體患有頸動脈粥樣硬化性狹窄的風險是非等位基因G攜帶者的1.99倍(OR=1.994，95%CI=1.068～3.761)。結論胰島素受體底物-2的Gly1057Asp基因多態性可能與頸動脈粥樣硬化性狹窄有關，等位基因G可能是頸動脈粥樣硬化性狹窄的獨立危險因素。

【關鍵詞】胰島素受體底物-2單核苷酸多態性頸動脈粥樣硬化危險因素

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.02.003

近年來隨著人口基數不斷增大、生活水平逐漸提高、人口老齡化現象越來越突出等因素的影響，腦血管病發病率呈逐年遞增趨勢，其中以較高發病率、腦致殘率、高復發率、較病死率的缺血性腦血管病最常見[1]。頸動脈粥樣硬化是導致缺血性腦卒中重要的危險因素之一。研究表明，20%-30%的腦卒中是頸動脈顱外段狹窄進行性病變所致。

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因組DNA序列上群體發生頻率大于1%的單個核苷酸差異。近來的研究表明，SNP作為一個單個核苷酸水平的基因多態性，其本身也可影響基因的功能。本研究從SNP水平分析入組患者的Gly1057Asp基因多態性與頸動脈粥樣硬化性狹窄的關系。

1對象與方法

1.1研究對象

以2014年10月～2015年7月在山東省濰坊市人民醫院神經內科住院的北方漢族人群并行頸部血管彩超證實有頸動脈狹窄，按照頸動脈粥樣硬化的超聲分型，取Ⅳ型以上者即狹窄≥50%的患者[2]為實驗組(本實驗中的狹窄指供應顱內前循環的頸動脈顱外段，即雙側頸內動脈顱外段和雙側頸總動脈)共96例，男57例，女39例，年齡42～79歲，平均年齡(66.23±8.52)歲；健康對照組(即頸動脈狹窄<50%或無頸動脈狹窄的患者=79例，男40例，女39例，年齡41～76歲，平均年齡(65.71±9.95)歲。納入標準：(1)能完成入院后的血生化及頸部血管彩超等各項檢查；(2)年齡均在40～80歲；(3)取得所有入選患者的均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)不能完成相關檢查；(2)頸部血管彩超圖像質量不佳；(3)嚴重營養不良、嚴重的心、肝、腎疾病、明顯肺部感染、甲狀腺疾病、周圍血管病、血液病及近3個月服用雌性激素患者；(4)先天性頸動脈缺如或非動脈粥樣硬化性狹窄者。

1.2一般資料及血液標本的收集

所有入院患者及門診患者均完成病史采集，記錄其年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史、血脂異常史。取晨起空腹肘靜脈血測定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血糖、糖化血紅蛋白等水平，并測量身高、體重、血壓等一般指標。同時采取肘靜脈血2 ml置于EDTA-Na管中于-70 ℃冰箱中保存備用。

1.3DNA提取

采用上海康為世紀有限公司生產的血液基因組非柱式提取試劑盒(FlexGen Blood DNA Kit)操作步驟提取DNA。提取后的基因組DNA于-20 ℃冰箱中凍存備用。

1.4基因型檢測

1.4.1多聚酶鏈反應(PCR)擴增目的片段 根據Gly1057Asp基因多態性和已知的基因序列，使用引物設計軟件(Primer Premier 5.0)設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，上游引物：5'-CTCCTTGGACGGCCTCCTGT-3'，下游引物：5'-CGACACCTGCTCCATGAGGC-3'；PCR反應體系(50 uL)包括2×Es Taq MasterMix (Es Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2×)25 uL，上、下游引物各2 uL，模板DNA 2 ug，剩余體系由去核糖核酸酶水(RNase-Free Water)補齊，PCR反應條件：預變性95 ℃ 5 min，然后以變性95 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s循環30次，最后終末延伸72 ℃ 10 min，反應結束后短暫離心, 分別吸取擴增產物5 uL、DNA Marker 5 uL，用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析PCR擴增產物特異性；擴增片段大小為346 bp(圖1)。

1.4.2PCR產物酶切鑒定酶切反應體系(25 uL)包括HaeⅡ(由New England Biolabs公司設計合成)0.5 uL，10X NEBuffer 2.5 uL，PCR產物0.5 ug，余由RNase-Free Water補足體系;置于37 ℃恒溫箱中30 min后取酶切產物5 uL電泳驗證酶切；可以看到3種基因型； GG型為174 bp、87 bp和85 bp共3條帶， GA型346 bp、 174 bp和172 bp 3條帶， AA型為174 bp 和172 bp 2條帶(圖2)。

M為DNAMarker;1-5為PCR產物圖1 Gly1057Asp基因PCR產物電泳

M這DNAMarker;1,4為G/G型;2,5為G/A型;3為A/A型;因174bp和172bp、87bp和85bp相隔太近,電泳圖上表現為重疊現象圖2 Gly1057Asp基因各基因型酶切片段電泳

1.5隨機選取部分PCR擴增產物標本送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序，驗證酶切

1.6檢驗效能使用軟件G*Power3.1.7，對本實驗的試驗參數進行可行性計算。輸入參數(Effect Size=0.24、a=0.05、Total sample size=175)，得出Power(1-β)=0.8，該實驗檢驗效能較高。

1．7統計學處理

2結果

2.1測序(圖3、4、5)箭頭所示處為SNP位點。

圖3 AA型

圖4 GG型

圖5 G/A型

2.2一般資料比較實驗組與對照組中性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓病史、甘油三酯、LDL-C、HDL、BMI水平差異不明顯(P>0.05)；總膽固醇水平、冠心病史、糖尿病史差異明顯(P<0.05)(表1)。

2.32組基因型和基因型頻率比較按自由度=2，查χ2介值表(實驗組χ2=0.28，則P>0.05；對照組χ2=0.18，則P>0.05)，因此2組樣本基因型觀察值與期望值檢測符合Hardy-Weinberg平衡。 IRS-2的基因Gly1057Asp中G的等位基因頻率在實驗組和對照組中分別為78.6%和68.4%(χ2=4.771，P<0.05)；G/G的基因型頻率在實驗組和對照組分別為63.5%和48.1%(χ2=4.205，P<0.05)(表2)。

2.4頸動脈粥樣硬化危險因素的多變量回歸分析以有無頸動脈狹窄作為因變量，以總膽固醇、糖尿病史、冠心病史以及等位基因G為自變量，采用成組資料的非條件概率Logistic回歸分析顯示，糖尿病史、冠心病史進入回歸方程，糖尿病史、冠心病史、等位基因G是頸動脈粥樣硬化性狹窄的獨立危險因素(表3)。

表1　一般資料比較(例，)

注: TC為總膽固醇; TG為甘油三酯; LDL-C為低密度脂蛋白; HDL-C為高密度脂蛋白; HDL-C為高密度脂蛋白; BMI為身高體重指數

表2　兩組基因型及等位基因頻率比較(例，%)

注: 與對照組比較，*P<0.05

表3　頸動脈粥樣硬化危險因素的多變量回歸分析

3討論

動脈粥樣硬化作為心、腦血管疾病最重要的危險因素之一，盡管研究已經證實其發病與吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、血脂異常等多種危險因素有關，但這只能作為部分患者發病原因。越來越多的研究表明，遺傳易感性在動脈粥樣硬化及其腦卒中的發生、發展中起重要作用[3]。目前發現與動脈粥樣硬化相關的易感基因有腎素血管緊張素系統相關基因[4]、載脂蛋白E基因[5]、對氧磷酶基因[6]、過氧化物酶體增殖物激活受體基因[7]、白細胞介素-6基因[8]、人類磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因[9]等。

胰島素受體基因表達的改變可使胰島素受體(Insulin receptor substrate,IRS)的結構發生改變，從而使IRS的功能發生變化，導致胰島素抵抗，繼發糖及脂代謝紊亂、高血壓以及微動脈損害，這些都參與動脈粥樣硬化的發生與發展[10]。胰島素受體底物-2(Insulin receptor substrate-2,INS-2)是1995年由Araki等[11]成功克隆出來的。IRS-2是主要的胰島素信號分子，它廣泛表達于各組織中，參與胰島素依賴的促細胞分裂和細胞內糖代謝的調節。IRS-2基因密碼子Gly1057Asp多態性為編碼區的單核苷酸多態性(SNP)，使氨基酸序列1057位由甘氨酸變異為天冬氨酸(Gly→Asp)。這一突變不僅與細胞胰島素敏感性改變有關，還能改變IRS-2與下游的信號分子的相互作用[12]。在若干已知的IRS-2基因多態性中Gly1057Asp的等位基因替換發生相對較為頻繁，適合在小樣本人群中進行研究。關于Gly1057Asp基因多態性與相關疾病的研究報道并不罕見。2003年Stefan[13]等人研究發現，Gly1057Asp基因多態性與肥胖相互作用影響β細胞功能；2012年Mazzoccoli[14]等研究發現，IRS-2的Gly1057Asp 基因多態性與胰島素抵抗程度(通過 HOMA 指數評估)和心外膜脂肪厚度呈正相關，表明其是總心肌代謝風險的因素之一；Villuendas[15]、Ruan[16]、Lin[17]等先后研究了該基因多態性與多囊卵巢綜合征的相關性，而在2012年Shih-Hung Chan等[18]發現IRS-2的Gly1057Asp基因多態性與冠狀動脈粥樣硬化有關，IRS-2的1057位等位基因G是冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素，而等位基因A則是它的保護因素。但是關于該基因多態性與頸動脈粥樣硬化的相關性研究尚未見報道。

本研究以濰坊市人民醫院住院及門診的北方漢族患者為研究對象，通過PCR-RFLP技術探討了IRS-2的Gly1057Asp基因多態性與頸動脈粥樣硬化性狹窄的相關性。本研究實驗組中等位基因A的頻率分別為21.4%，明顯低于對照組31.6%；等位基因G的攜帶率在試驗組和對照組中分別為78.6%和68.4%(P均<0.05)。實驗組中擁有G/G基因型的個體與對照組比較，差異較明顯(χ2=4.205，P=0.04)。通過Logistic回歸分析發現，攜帶等位基因G的個體患有頸動脈粥樣硬化性狹窄的風險是非等位基因G攜帶者的1.99倍(OR=1.994，95%CI=1.068～3.761)，本研究推測等位基因G可能與糖尿病、冠心病一樣，是頸動脈粥樣硬化性狹窄的獨立危險因素，而等位基因A則是頸動脈粥樣硬化性狹窄的保護性因素，這與Shih-Hung Chan等人關于冠狀動脈粥樣硬化性狹窄的研究結果一致。但是本研究由于樣本含量及所選人群種族的差異，高血壓病、甘油三酯等常見的頸動脈粥樣硬化的危險因素未在本研究中得到證實，這有待通過進一步擴大樣本含量等方式進行改進。

IRS-2的Gly1057Asp基因可能是頸動脈粥樣硬化性狹窄的易感基因之一，通過篩查該基因多態性可能對于頸動脈粥樣硬化性狹窄的提前發現及預防提供更好的臨床依據。頸動脈粥樣硬化性狹窄是基因與環境等多方面因素相互作用的疾病。通過近年來的研究發現，基因多態性與其表達有密切關系。本研究由于實驗技術、儀器、樣本含量等多方面原因，尚有許多有待完善的地方。另外，頸動脈粥樣硬化性狹窄是多基因疾病，應根據其病理生理改變，選擇更多的候選基因從不同方面分析，以便于篩查出更多的相關基因，更全面地闡述頸動脈粥樣硬化性狹窄的發病機制。

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(2015-03-11收稿2015-09-29修回)

The association between Gly1057Asp polymorphism of insulin receptor substrate-2 and carotid atherosclerosisZhang

Meng*，ZhongChi*，FuWenyu*，etal.

*DepartmentofNeurology,WeifangPeople'sHospitalAffiliatedtoWeifangMedicalUniversity,Weifang261000

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the association between the Gly1057Asp polymorphism of insulin receptor substrate-2 and carotid atherosclerosis. To explore the genetic mark of the susceptibility of carotid artery stenosis. Methods96 Patients with greater than or equal to 50% carotid artery stenosis and 79 healthy controls who were the Han nationality in the north were choosed to detect the Gly1057Asp polymorphism by the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique, and all of them had been received cervical vascular color ultrasonic inspection. The allele frequency, genotypes frequency between the two groups were compared. The relationship between Gly1057Asp polymorphism and carotid ar-tery stenosis was explored. ResultsThe G allele frequency in the experimental group (78.6%) was signifi-cantly higher than that in the control group (68.4%)(P<0.05);The G/A+A/A genotypes in the experimental group (36.5%) were obviously lower than that in the control group (51.9%)(P<0.05). The patients with allele G had a 1.99-fold increased risk for carotid artery stenosis compared with those people who had no allele G(OR=1.994, 95%CI 1.068-3.761).ConclusionsThe Gly1057Asp polymorphism of insulin receptor substrate-2 is probably associated with carotid artery stenosis,and the allele G may be a risk factor for carotid artery stenosis.

【Key words】Insulin receptor substrate-2Single nucleotide polymorphismCarotid atherosclerosisRisk factors

【中圖分類號】R749.1

【文獻標識碼】A

【文章編號】1007-0478(2016)02-0083-05