一株白僵菌菌株的分離鑒定及對紫薇梨象成蟲致病力的初步研究

張建華　查玉平　陳京元　王義勛　蔡三山　洪承昊　趙東容

摘 要：為了得到用于防控紫薇梨象的高毒力菌株，本試驗從野外螢火蟲僵蟲體表分離出一株白僵菌，通過形態學和分子生物學方法鑒定為球孢白僵菌。致病力研究表明，菌株的孢子濃度達到106個孢子/ mL時，對紫薇梨象的致死率為62.5%，具有成為紫薇梨象成蟲生物農藥的潛力。

關鍵詞：白僵菌；紫薇梨象；真菌殺蟲劑

中圖分類號： S476.12文獻標識碼： A文章編號： 1004-3020（2016）02-0037-03

Abstract：In order to screen highly pathogenic strains to Pseudorobitis gibbus Redtenbacher， a strain of Beauveria sp. was isolated from dead firefly. The isolate was identified as B. bassiana by morphological characteristics and the method of molecular biology. P. gibbus was sprayed with a suspension of fungal spores with 1× 106 mL， and the corrected mortality of adults was 62.5% after 15 d. It indicated that the strain of B. bassiana can be applied to biological control of P. gibbus in fields.

Key words：Beauveria bassiana； Pseudorobitis gibbus； fungal pesticides

紫薇梨象Pseudorobitis gibbus是一種危害紫薇Lagerstroemia indica的重要害蟲，主要分布于湖北、山東、江蘇、陜西等地[]。紫薇梨象的成蟲和幼蟲均對紫薇造成危害。其成蟲取食嫩葉、嫩梢、花以及幼嫩種子等，幼蟲則鉆蛀花萼、幼嫩蒴果、種子[2]。目前，對紫薇梨象有較好防治效果的農藥有阿維菌素[3]、吡蟲啉、氰戊菊酯、甲維鹽[]等。

白僵菌是一種對較多農林害蟲具有較好防治成效的真菌殺蟲劑[4]，但是對紫薇梨象的生物防治研究尚未見報道。本研究從林間采集的螢火蟲僵蟲上分離純化出一株白僵菌菌株，并通過形態學和分子生物學方法進行鑒定。本研究用分離出的菌株對紫薇梨象進行了感染試驗，以期獲得紫薇梨象的高效致病菌株，為其生物防治奠定基礎。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株來自蘄春林間采集到的1頭螢火蟲僵蟲。

1.2 菌株分離、純化與鑒定

直接在僵蟲體表挑取菌絲和孢子粉進行分離。在PDA培養基上培養14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1 %吐溫-80的無菌水配制成濃度為1×10個/mL的孢子懸浮液，然后用接種針分別將孢子懸浮液點植于PDA平板培養基（3 個培養皿），每皿3 點，成正三角形排列，最后置于26 ℃恒溫培養箱中培養。第7 d觀察記錄菌落形態特征。同時挑取少量菌絲和孢子，在顯微鏡下進行形態學鑒定。

分子生物學鑒定采用ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 區域的特異性PCR擴增，而后測序比對。引物為ITS1F（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）， PCR體系（25 μL）：10× Taq 酶緩沖液，dNTP 各200 mm，MgCl2 3.7 mm，引物各0.4 mm，Taq 酶2 U，模板DNA 5～ 10 ng。PCR 擴增程序為：94 ℃1 min，1 個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 個循環；最后72 ℃ 7 min。DNA測序由寶生物工程有限公司完成。在GenBank進行檢索比對同源序列。

1.3 感病力測試

采用噴霧法測試。野外分離的白僵菌菌株在PDA培養基上培養14 d（26 ℃）后，取分生孢子以0.1% 吐溫-80的無菌水配制成濃度為1× 107個孢子/mL的孢子懸浮液，而后再10倍梯度稀釋成 1× 106個孢子/mL、1× 105個孢子/mL的孢子懸浮液。選擇羽化期相同的紫薇梨象成蟲進行測試，將配置好的白僵菌孢子懸浮液分別對試蟲噴霧處理。每個處理組10頭，重復4次。以清水做對照。處理后置于27±1℃， 60%～80% RH，L∶D= 14∶10的人工氣候箱內飼養，及時補充新鮮無污染的紫薇葉片。第3 d、7 d、15 d觀察試蟲死亡情況。死亡判定：用昆蟲針觸碰蟲體，如無動作即為死亡。。

1.4 數據調查與統計分析

感染后第3 d、7 d、15 d檢查死蟲數，根據公式計算死亡率，并統計校正死亡率。

蟲口死亡率（%）= 感染前活蟲數-感染后活蟲數 感染前活蟲數 ×100

感染效果（%）= PT-CK 100-CK） ×100

式中： PT—菌液處理后的蟲口死亡率

CK—空白對照的蟲口死亡率

用DPS2000軟件對數據進行新復極差法統計分析。

2 結果與分析

2.1 形態學及分子生物學鑒定

分離的菌株在PDA培養基上培養，其菌落為白色，絨毛狀，有同心環，表面平坦無褶皺，有放射溝。在顯微鏡下，分生孢子為光滑無色的球形，確定該菌株屬半知菌亞門Deuteromycotina絲孢綱Hyphomyceres叢梗孢目Moniliales叢梗孢科Moniliaceae白僵菌屬Beauveria。

分離菌株的序列登陸GenBank檢索表明，與該菌株序列同源性最高的菌株為球孢白僵菌，同源性為100 %。結合形態學鑒定結果，所分離菌株確定為球孢白僵菌Beauveria bassiana。

2.2 感病力測定結果

從表1中可以看出，從螢火蟲僵蟲上分離的菌株對于紫薇梨象成蟲具有較好的感病效果。在施藥后15 d，1× 106個孢子/mL和1×107個孢子/mL的孢子懸浮液的防效都達到60 %以上。因此，該菌株具有成為紫薇梨象成蟲專用型生物農藥的潛力。

3 討論

紫薇是一種優良的庭院觀賞樹和綠化行道樹，具有重要的觀賞和經濟價值[5]。紫薇梨象在2007年首次被發現對泰安市紫薇造成嚴重危害，隨后在湖北、安徽等地相繼有危害紫薇的報道[3-6]。該蟲危害紫薇的整個發育時期，具有種群數量大、擴散快、危害的時間長等特點，大大降低了紫薇的觀賞價值，并威脅到種實繁殖[7]。如何有效防治紫薇梨象成為森保科研工作者的重要課題。

白僵菌是一類寄主范圍廣、持效性良好，與環境友好，對人畜無害的生物農藥[4]。而且白僵菌的工業化生產已經比較成熟，可以大批量生產用于生物防治。本研究分離的白僵菌菌株對紫薇梨象成蟲具有較強的感病力，根據該蟲的生物學特性，在林間噴灑白僵菌可以有效防治成蟲，為其生物防治提供新途徑。

參 考 文 獻

[1]李艷，周光鋒，于麗穎，等. 8種藥劑對紫薇梨象成蟲的室內毒力測定及室外藥效試驗[J]. 中國森林病蟲，2013，32（4）：30-33.

[2]王菊英，周成剛，喬魯芹，等. 嚴重危害紫薇的新害蟲——紫薇梨象[J]. 中國森林病蟲，2010，29（4）：18-20.

[3]查玉平，洪承昊，胡孜進，等.阿維菌素對紫薇梨象的室內毒力評價[J]. 湖北林業科技，2010，（6）：30-31.

[4]查玉平，陳京元，夏劍萍. 白僵菌防治森林害蟲的研究與應用[J]. 湖北林業科技，2010，（3）：40-42，39.

[5]靳曉翠，范義榮. 紫薇種質資源概況及應用現狀分析[J]. 河北農業科學，2009，13（1）：16-17，20.

[6]唐長貞，唐燕平，康克，等. 皖西南紫薇梨象生活史與危害特性研究[J]. 南京林業大學學報（自然科學版），2015，39（6）：177-180.

[7] 劉大川，周成剛，李艷，等. 紫薇梨象的危害與紫薇生長發育的關系[J]. 環境昆蟲學報，2011，33（3）：302-307.

（責任編輯：鄭京津）